最新十一章生物素亲合素放大技术精品课件.ppt

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1、十一章生物素亲合素放大十一章生物素亲合素放大技术技术第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记一、理化特性一、理化特性二、亲合素（或链酶亲合素）的标记二、亲合素（或链酶亲合素）的标记第一节第一节 生物素的理化性质与标记生物素的理化性质与标记一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素标记蛋白质二、活化生物素标记蛋白质标记蛋白质巯基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺- -丙酰丙酰- -生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素生物素 标记核酸的活化生物素标记核酸的活化生物素光

2、生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin) 侧链上连接的芳香基叠氮物基团侧链上连接的芳香基叠氮物基团, , 经光照后经光照后, , 变为变为芳香芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, , 形成形成B-B-核酸核酸探针探针 生物素脱氧核苷三磷酸生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP） 作为作为TTPTTP的结构类似物，可采用缺口移的结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链位法掺入到双链DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接标记核酸，可直接标记核酸，但对但对碱基配对碱基配对有影有影响。响。 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；活化生物

3、素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性；一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性； 对对BNHS多标记抗体多标记抗体, BHZ则多标记微酸性抗原；则多标记微酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变；抗原、抗体标记后活性不变； 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低；活性将降低；二、生物素标记蛋白质二、生物素标记蛋白质 选择活化生物素：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：控制生物

4、素：蛋白质比例蛋白质比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜为宜为2:1, IgG2:1, IgG应用浓度应用浓度 0.50.55 5g/ml; 生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag，3 35 5个个/Ab/Ab； 使用交联臂减少空间阻力使用交联臂减少空间阻力第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记化性质与标记亲合素亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有

5、用于标记的物质均可以同亲合素（有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链）或链酶亲合素（酶亲合素（SA）结合。）结合。 结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位结合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315 1515 151818一、理一、理 化化 特特 性性二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素标记链霉亲合素标记 标记物：标记物：酶、胶体金酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 过碘酸钠、戊二醛过碘酸钠

6、、戊二醛 ABC/SABC 预制预制AV(SAV)-Biotin第三节第三节 生物素生物素- -亲合素系统的特点亲合素系统的特点一、灵敏度一、灵敏度二、特异性二、特异性三、稳定性三、稳定性四、适用性四、适用性五、其他五、其他第四节第四节 生物素生物素- -亲合素系统的应亲合素系统的应用用生物素与亲合素之间结合的亲合生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使时具有的多级放大作用等优越性，使BASBAS及其相关技术被广泛应用在各种标及其相关技术被广泛应用

7、在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。献。 一、生物素一、生物素- -亲合素系统基本类型亲合素系统基本类型及原理及原理BABBAB法：法： Ag+BAb Ag-AbB Ag+BAb Ag-AbB A A Ag-AbB-A Ag-AbB-A BE BE Ag-AbB-A-BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离特点：以游离A A分别连接分别连接B-AbB-Ab和和B-E B-E BABA法法Ag+BAb Ag-AbB Ag+BAb Ag-AbB AE AE Ag-AbB-A- Ag-AbB-A

8、-BEBE特点：以特点：以A-E/SA-EA-E/SA-E代替代替BABBAB法中的法中的A A，省，省 却了加却了加B-EB-E的步骤的步骤3. 3. ABC ABC法法 A+BE A- BE-ABC A+BE A- BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB Ag+BAb Ag-AbB ABCABC Ag-AbB- Ag-AbB-ABC ABC 特点特点: :将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B-EB-E结合，制备成复合物结合，制备成复合物ABCABC二、生物素二、生物素- -亲合素系统在酶免疫亲合素系统在酶免疫测定中的应用测定中的应用BASBAS在在ELISAELISA中的应用中的

9、应用 生物素生物素- -亲合素系统在均相酶免疫测定亲合素系统在均相酶免疫测定 三、生物素三、生物素- -亲合素系统在荧光免亲合素系统在荧光免疫技术中的应用疫技术中的应用 BAS BAS用于荧光抗体技术，通常采用用于荧光抗体技术，通常采用BABA法，法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（抗体和荧光素标记的生物素（BABBAB法）或法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）

10、抗体的夹心法。抗体的夹心法。 四、生物素四、生物素- -亲合素系统在放射免亲合素系统在放射免疫测定中的应用疫测定中的应用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)(IRMA)检测体系偶检测体系偶联，用于对终反应的放大（联，用于对终反应的放大（BABA法）法） BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反应后反应后B B、F F成分的分离成分的分离 五、生物素五、生物素- -亲合素系统在分子生亲合素系统在分子生物学中的应用物学中的应用以生物素标记核酸探针进行的定位检测以生物素标记核酸探针进行的定位检测用用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化纯

11、化将免疫测定技术与将免疫测定技术与PCR结合建立免疫结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测用于抗原的检测 思考题思考题生物素的分子结构特点是什么？生物素的分子结构特点是什么？生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？为什么亲合素、链霉亲合素具有为什么亲合素、链霉亲合素具有“桥联桥联”作用？作用？亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？为什么生物素亲合素系统具有放大作用？为什么生物素亲合素系统具有

12、放大作用？生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同？相同？生物素亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号生物素亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号的能量？的能量？生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？如何将生物素链霉亲合素放大系统用于所有双位点如何将生物素链霉亲合素放大系统用于所有双位点ELISA?ELISA?小小 结结 生物素生物素亲合素（链霉亲合素）系统具有的多亲合素（链霉亲合素）系统具有的多级放大独特效应，可极大地提高分析测定的灵级放大独特效应，可极大地提

13、高分析测定的灵敏度；二者之间的高亲和、高特异结合以及既敏度；二者之间的高亲和、高特异结合以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材料的特性，可偶联生物大分子，又可连接标记材料的特性，使该系统在标记免疫分析技术领域中的应用具使该系统在标记免疫分析技术领域中的应用具有很强的稳定性和适用性。该系统有二种基本有很强的稳定性和适用性。该系统有二种基本类型：以游离亲合素为中间物，分别连接包含类型：以游离亲合素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素的的BABBAB法或法或ABCABC技术；另一类是直接用标记亲合技术；另一类是直接用标记亲合素连接生物

14、素化大分子反应体系进行检测的素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BABA法或法或LABLAB。 在生物素在生物素亲合素（链霉亲合素）放大系统应亲合素（链霉亲合素）放大系统应用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素结合（结合（BABA、LABLAB法），或依次与亲合素（链霉法），或依次与亲合素（链霉亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合物（物（BABBAB、ABCABC法），最终使待测反应信号被放法），最终使待测反应信号被放大，提高检测方法的灵敏度。大，提高检测方法的灵敏度。 29 结束语结束语