生殖干细胞的研究进展.pdf

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1、国际生殖健康/计划生育杂志 2 0 1 9年5月第3 8卷第3期 JIn tR e p ro dH e a lth蛐F a m P la n ,M a y2 0 1 9熏V o l.3 8熏N o .3 综 述 作者单位： 730000 兰州大学第一医院生殖专科医院， 甘肃省生殖医 学与胚胎重点实验室 通信作者： 张学红， E-mail： 审校者 贾天玉， 刘龙会， 沈豪飞， 张学红 【摘要】卵巢中始基卵泡是女性的基本生殖单位， 也是卵细胞储备的唯一形式。传统观点认为， 出生 后卵母细胞数量不再增加， 随着卵泡的发育、 成熟和闭锁， 卵母细胞不断耗竭， 卵巢功能衰退， 从而进入绝经 期。 随着

2、人类在干细胞研究领域不断深入， 应用干细胞治疗相关疾病已成为现实。 在临床应用中， 骨髓造血干 细胞移植成为白血病等血液系统疾病患者的重要治疗方式。 近年来， 研究人员在成年小鼠卵巢内发现进行有 丝分裂的生殖细胞， 可能参与卵母细胞再生， 这种细胞很可能就是生殖干细胞 （GSCs） 。GSCs的存在为卵巢功 能不全、 卵巢早衰和恶性肿瘤患者生育力保存及绝经后期女性健康维护带来希望。 现就GSCs的研究进展进行 综述。 【关键词】干细胞； 卵母细胞； 卵巢； 再生； 治疗 Research Progress of Germline Stem CellsJIA Tian-yu，LIU Long-h

3、ui，SHEN Hao-fei，ZHANG Xue-hong. ReproductiveMedicineSpecialistHospital，TheFirstHospitalofLanzhouUniversity，KeyLaboratoryof Reproductive Medicine and Embryo in Gansu，Lanzhou 730000，China Corresponding author：ZHANG Xue-hong，E-mail： 【Abstract】The primordial follicle as the basic reproductive unit of wo

4、men is the only form of oocyte reserve. The traditional view is that the number of oocytes no longer increases after birth. With the development, maturation and atresia of follicles, the oocytes are continuously depleted. Women with the declined ovarian function will go through the menopause. With t

5、he research progress of human stem cells, the application of stem cells in clinical treatment has become a reality. For example, the bone marrow hematopoietic stem cell transplantation has become an important treatment for those patients with blood system diseases such as leukemia. Recently, researc

6、hers have discovered mitotic germ cells in the ovary of adult mice. This kind of mitotic germ cell may be involved in oocyte regeneration, which is likely to be germline stem cells(GSCs). GSCs brings the hope of fertility preservation for those women with primary ovarian insufficiency (POI), prematu

7、re ovarian failure (POF) and malignant tumors, and the hope of health maintenance for postmenopausal women. The research progress of GSCs and potential clinical application were reviewed in this paper. 【Keywords】 Stem cells；Oocytes；Ovary；Regeneration；Therapy （ 蛐 ，2019，38：222-225） 生殖干细胞 （germline ste

8、m cells， GSCs） 1又称卵 巢干细胞 （ovarian stem cells） 2、 卵母干细胞 （oocyte- stem cells） 3或原始生殖细胞 （primordial germ cells）4。 自胚胎形成后， 卵泡便进入自主发育和闭锁的生理 过程， 该过程不依赖于促性腺激素。胚胎形成6周后 原始性腺开始分化， GSCs不断有丝分裂，细胞数增 多， 体积增大， 称为卵原细胞 （oogonia） ， 约60万个。 胚胎形成810周原始性腺才出现卵巢结构。自胚胎 形成1112周， 卵原细胞进入第一次减数分裂， 称为 初级卵母细胞 （primary oocyte） 。 在胚

9、胎形成1620周 时， 生殖细胞数量达到峰值， 双侧卵巢共约600 700万个生殖细胞， 其中卵原细胞占1/3， 初级卵母细 胞占2/3。 从胚胎形成第16周至出生后6个月， 单层梭 形前颗粒细胞包绕在初级卵母细胞周围形成始基 卵泡， 这是女性的基本生殖单位， 也是卵细胞储备 的唯一形式。胎儿期的卵泡不断闭锁， 出生时大约 有200万个， 儿童时期大多数卵泡发生退化， 至青春 期只剩下约30万个。进入青春期后， 卵泡自主发育 成熟的过程依赖于促性腺激素的刺激， 育龄期每月 发育一批卵泡 （311个） ， 经过募集、 选择， 其大多数 情况下只有1个优势卵泡可以完全成熟并排卵形成 黄体， 其余的

10、卵泡发育到一定程度后闭锁。在围绝 经期， 卵巢功能逐渐下降， 卵泡数量明显减少， 易发 生卵泡发育不全。绝经后期卵巢停止分泌雌激素， 卵巢功能完全衰竭。女性一生中只有400500个卵 泡最终成熟并排卵， 仅占总数的0.1%左右。一般认 为卵母细胞在雌性哺乳动物出生后不会再生。 Johnson等5在雌性小鼠卵巢内发现GSCs， 但现阶段 222 国际生殖健康/计划生育杂志 2 0 1 9年5月第3 8卷第3期 JIn tR e p ro dH e a lth蛐F a m P la n ,M a y2 0 1 9熏V o l.3 8熏N o .3 GSCs理论体系尚未完善， 仍需进一步研究。 1G

11、SCs的提出 GSCs是否存在备受争议。早在1870年， 有学者 基于不同种类哺乳动物 （包括人类、 猫、 狗） 的研究 发现， 雌性哺乳动物在出生后极短时间内卵母细胞 数量便停止增长4。1920年Arai6证实随着大鼠年龄 的增长， 卵泡数目减少， 同时提出假设大鼠青春期 前切除一侧卵巢（半绝育） ，如果卵巢没有代偿机 制， 那么切除一侧卵巢的大鼠卵母细胞数量应该是 正常大鼠卵母细胞数量的一半，但Arai没有进行相 关验证。1923年Allen7继续Arai的研究， 在大鼠青春 期前切除一侧卵巢， 发现切除一侧卵巢的大鼠与正 常大鼠在组织学上均存在进行有丝分裂的卵巢上 皮细胞， 并且在切除一

12、侧卵巢的大鼠中有丝分裂生 殖细胞数量与生殖周期不同阶段密切相关， 暗示细 胞周期性增长的规律， 认为进行有丝分裂的卵巢上 皮细胞是大鼠出生后卵母细胞再生的标志。然而这 些进行有丝分裂的细胞也可能仅是卵泡代偿的一 种表现， 即切除一侧卵巢后， 另一侧卵巢卵泡中卵 泡膜细胞和颗粒细胞发生代偿性有丝分裂。进一步 说， 即使没有卵母细胞再生， 这种代偿机制也会发 生。 1951年Green等8总结已有研究， 认为没有明确证 据表明GSCs的存在， 从而说明哺乳动物出生后没有 卵母细胞再生。 1962年Peters等9也证实了这一观点， 为了研究小鼠卵泡中DNA的合成， 将具有放射性的 胸腺嘧啶核苷酸经

13、腹腔给予不同妊娠时间小鼠， 发 现到胚胎形成第18天时胚胎的DNA合成已经变得 非常缓慢， 即在小鼠胚胎形成的前18天是DNA合成 的主要时期， 说明出生后小鼠卵巢中的GSCs都是来 自胎儿时期。但在此后近半个世纪中， 有关哺乳动 物卵母细胞再生的研究处于停滞状态。 2GSCs的发现 2004年， Johnson等5研究观察C57BL/6雌鼠卵泡 数量变化时发现，在出生后30 d卵泡闭锁速度开始 迅速增高，至出生后42 d未闭锁卵泡数量仅为出生 时卵泡总数的1/3 （500个左右， 包括原始卵泡和发育 早期的初级和次级卵泡） ，推测出生后卵泡不断闭 锁， 但基于卵泡闭锁的速度， 这一时期已闭锁

14、卵泡 总数至少有1 200个，多于实际卵泡闭锁的数量， 表 明存在卵母细胞再生。因此他们认为哺乳动物出生 后卵巢中存在GSCs， 并且参与卵泡和卵母细胞的再 生。 Johnson等5进一步研究发现， 在雌鼠卵巢上皮细 胞层发现联会复合体蛋白3（synaptonemal complex protein 3， SCP3） 、 小鼠瓦萨同源物蛋白 （mouse vasa homologueprotein， MVH）和 溴 脱 氧 尿 苷 （bromodeoxyuridine， BrdU） 均为阳性的细胞。 SCP3在 减数分裂细胞中表达， 通常用于追踪脊椎动物的性 腺分化时间， SCP3免疫反应定位

15、于生殖细胞，包括 减数分裂卵母细胞、 精母细胞和减数分裂前精原细 胞10。MVH是果蝇VASA蛋白在小鼠体内的同源物， 特异地表达于发育中的生殖细胞，人类VASA基因 也仅在卵巢和睾丸中表达， 表明该细胞属于生殖细 胞系11。 BrdU阳性表明细胞正在增殖12。 因此Johnson 等5认为SCP3、 MVH和BrdU均为阳性的细胞极有可 能就是生殖干细胞。2005年Bukovsky等13获取成年 女 性 卵 巢 表 面 上 皮 （ovarian surface epithelium， OSE） ， 在含有雌激素存在的培养基内培养后分化为 具有卵母细胞特征的细胞 （直径为180 m） ， 并表

16、达 上皮细胞表面特征性细胞角蛋白 （cytokeratin， CK） ， 如CK116、 CK5、 CK6和CK8等； 该细胞还可发育至胚 泡破裂、 排出极体， 并表达减数分裂中起重要作用 的糖蛋白PS1、 透明带蛋白 （zonapellucida， ZP） ， 具有 次级卵泡的特征。在不含有雌激素的培养基内则分 化成直径仅为15 m的细胞， 如颗粒层细胞、 上皮细 胞、 神经细胞或表达波形蛋白的间质细胞。 2008年， Bukovsky等14分离了3例卵巢早衰患者 的少量卵巢表面组织， 在含有雌激素的培养基中体 外培养。培养至第3天， 形成了卵泡样结构； 2例组织 在体外受精后出现胚胎样结构

17、， 在形成囊胚样结构 后冷冻保存。该研究表明， 卵巢早衰患者卵巢中存 在GSCs，经体外培养能发育成为成熟的卵母细胞， 并具备受精能力， 为解决卵巢早衰患者的生育问题 提供了新思路。 2009年， Zou等15用免疫荧光双标记法筛选出 MVH和BrdU双阳性细胞，将绿色荧光蛋白 （green fluorescen tprotein， GFP） 基因导入这些细胞中， 随后 移植到经化疗后不孕小鼠的卵巢，发现这些细胞 能够产生新的卵子和后代， 后代中GFP基因的表达 阳性率为26%， 进一步证实了GSCs存在的可能。 2012年， White等16首次应用荧光激活细胞分类法 （fluorescen

18、ce activated cell sorting， FACS） 纯化成年 小鼠和人类卵巢皮质组织中稀有的具有有丝分裂 活性的细胞， 这些细胞与原始生殖细胞基因表达谱 一致， 同时进行体外培养产生与卵母细胞形态及基 因表达一致的细胞， 从而证实经FACS纯化的细胞为 GSCs。 White等16进一步将稳定表达GFP的GSCs注入 223 国际生殖健康/计划生育杂志 2 0 1 9年5月第3 8卷第3期 JIn tR e p ro dH e a lth蛐F a m P la n ,M a y2 0 1 9熏V o l.3 8熏N o .3 离体人卵巢皮质组织， 再将该组织植入到小鼠卵巢 中后产

19、生了GFP阳性的卵泡，说明GSCs在体内和离 体时均可产生卵母细胞。 2015年， Irie等17研究认为SOX17是GSCs的关键 调节因子。由于不能直接将人类胚胎用于研究， 2017年， Kobayashi等18使用与人类胚胎发育过程相 似、 经历双胚层过程猪的胚胎进行研究， 发现GSCs 起源于外胚层背侧， 此过程的发生是由于SOX17和B 淋巴细胞诱导成熟蛋白1 （B lymphocyte induced maturation protein 1， BLIMP1） 上调导致Wnt和骨形态 发生蛋白 （bone morphogenetic protein， BMP） 表达， 进 一步完善

20、了SOX17对GSCs作用的理论机制。同年， Risal等19研究小鼠微管相关丝氨酸/苏氨酸类似激 酶 （microtubule-associated serine/threonine kinase- like， MASTL） 对GSCs增殖的作用， 在GSCs中特异性 沉默MASTL， 发现MASTL沉默并未阻止有丝分裂开 始， 但导致细胞无法完成有丝分裂， 这表明MASTL 在GSCs有丝分裂中必不可少。结果表明， MASTL通 过调节磷酸酶活性影响胚胎发育中GSCs的有丝分 裂。2017年， Shin等20研究发现sohlh1和sohlh2基因 是卵母细胞分化的重要调节因素， 但不影响其

21、减数 分裂。同年Liu等21在雌性小鼠研究中发现， 小鼠出 生后13 d， GSCs有丝分裂呈活跃状态，该研究应用 磁珠分离GSCs， 为应用GSCs治疗卵巢功能障碍提供 希望。 2018年， Mochizuki等22研究发现组蛋白去乙酰 化酶3 （histone deacetylase3， HDAC3） 影响GSCs形成。 HDAC3缺乏导致体外和体内GSCs产生减少。GSCs 从胚胎中分化需要BMP4信号转导23， 但BMP4在 GSCs从胚胎中分化的具体作用机制尚不明确。2018 年Zhang等24在前人基础上对小鼠GSCs进一步研究 发现， 转录因子OTX2是GSCs形成的关键环节。体

22、内 和离体环境下，下调OTX2表达可促进胚胎分化为 GSCs； 当体外环境不存在OTX2时， 胚胎分化为GSCs 的效率增加且产生的GSCs活力更久； 体内环境不存 在OTX2时， 分化的GSCs数量更多。以上研究均证明 了GSCs的存在， 但仍有很多问题亟需解决， 比如如 何让卵巢早衰患者卵巢中的GSCs自发产生新的卵 子从而提高受孕可能？如何保证再生卵子质量及受 精率？这些问题仍有待进一步研究。 3目前GSCs的标志 2007年， Liu等25在小鼠脑组织和肾脏发现低水 平MVH表达， 这可能说明更多组织表达MVH， 不仅 仅是生殖细胞。 2016年Zarate-Garcia等26的研究也

23、证 实了这一观点。Liu等25选取少量人类卵巢皮质组织 未发现SCP3的表达， 可能因为GSCs不存在于卵巢皮 质， 也可能由于处于静止期的GSCs不表达减数分裂 细胞特异性蛋白。2011年， Parte等27研究认为c-Kit 对生殖细胞的分化至关重要， 同时也表达于成体干 细胞， 常用于小鼠GSCs的研究。2014年， Zhou等28研 究发现GSCs表达ZP， 并且可以区分GSCs与卵泡膜细 胞及颗粒细胞， 但是ZP仅在卵泡生长时表达。由于 伦理方面等因素， 人体卵巢组织的获得主要是通过 卵巢组织活检， 限制了获取组织的数量。如果GSCs 存在于卵巢髓质， 获取的少量卵巢组织根本无法检

24、测到。此外， 大多数获得的卵巢组织来源于卵巢相 关疾病患者， 已不具备正常卵巢功能。而且卵泡发 育和潜在的卵母细胞再生可能随月经周期变化， 组 织活检并不能观察到卵巢的周期性变化， 即使有少 量卵泡再生， 经统计分析可能最后被认为是误差也 不会有统计学意义。因而对于GSCs的鉴定有待进一 步研究。 4GSCs的应用 近年Baas29将GSCs来源的卵子线粒体移植到体 外 受 精 - 胚 胎 移 植 （in vitro fertilization -embryo transfer， IVF-ET） 患者自身的卵子中， 通过改善线粒 体供能提高卵子质量，从而获得尽可能高的IVF成 功率，同时可避免

25、使用赠卵的线粒体。2015年， Coghlan30通过注射GSCs来源的线粒体以提高卵子 质量， 最终获得IVF活产婴儿， 被称为第1例干细胞 婴儿。2017年， Zeng等31对雌性小鼠进行GSCs移植， 有效地恢复了卵子发生和内分泌功能， 然而在移植 后第4周， GSCs停止分裂， 不再有新卵泡发生， 但这 为GSCs进一步应用奠定了良好的基础。随着更多学 者对GSCs研究， 其应用范围会更加广阔。 5结语与展望 现阶段对小鼠GSCs的研究较多，通过Bukovsky 等14的研究证实了GSCs也存在于人出生后的卵巢组 织中， 但是对人的GSCs研究甚少。主要有两方面原 因， 一方面由于人的

26、卵巢组织获取困难及相关伦理 问题； 另一方面由于现有研究分离GSCs的方式主要 为磁珠分选和FACS，但因GSCs在卵巢组织中数量 少， 所以获得足够数目的GSCs尚有一定难度， 提取 GSCs技术有待进一步完善。除此之外， GSCs理论机 制有待完善， 现有研究不能解释绝经期妇女即使存 224 国际生殖健康/计划生育杂志 2 0 1 9年5月第3 8卷第3期 JIn tR e p ro dH e a lth蛐F a m P la n ,M a y2 0 1 9熏V o l.3 8熏N o .3 在GSCs为什么不能产生卵子， 卵巢早衰患者如何促 使GSCs产生卵子。虽然GSCs的研究尚不成熟

27、， 但是 其潜在临床应用价值已经逐渐被人们意识到32。 GSCs的研究一旦成熟， 便可为卵巢功能不全和卵巢 早衰的不孕患者、 要求保留生育力的恶性肿瘤患者 实现妊娠33。 随着对GSCs的研究不断深入， 新的进展 必将不断出现。 参考文献 1Silvestris E， Cafforio P， DOronzo S， et al. In vitro differentiation of human oocyte -like cells from oogonial stem cells: single -cell isolation and molecular characterizationJ.

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