CTAB法提取植物基因组DNA.doc
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1、如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流CTAB法提取植物基因组DNA【精品文档】第 4 页CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide),十六烷基三甲基溴化铵,是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,能与核酸形成复合物,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀,通过离心就可将其与蛋白,多糖类物质分开,在经过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(
2、0.7mol/L NaCl), CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。另外,它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。 主要试剂与溶液的配制:PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)巯基乙醇氯仿异戊醇(241)异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液:CTAB20g/LNaCl(58.44)1.4 mol/L(81.816g)EDTA(292.25)10 mmol/L(2.9225g)Tris(121.14)100 mmol/L(12.114g)pH 8.01TE
3、 缓冲液:EDTA(292.25)1 mmol/L(0.29225g)Tris(121.14)10 mmol/L(1.2114g)pH 8.0NaAC溶液:NaAC(82.03)3mol/L(246.09g)pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片,用液氮迅速研磨,中间加PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)少许,成粉末后转入10mL的离心管中,放入液氮或-80冰箱储存(在研磨样品时,研的细和研的粗,提出的DNA量可以相差几倍,所以,在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次)。2、将(200ml)CTAB溶液放于65水浴锅中预热。3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。4、速加3m
4、l预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中,之后放入65水浴锅中,保温3060min,期间轻摇数次(一般20min左右一次,刚投入水浴时可以稍快速的晃动,之后的晃动一定要轻柔)。5、加入34ml氯仿异戊醇(241)(在通风橱中操作),轻摇混匀至乳白色(100200次,剧烈晃动会使DNA机械切割)。6、1520,11000 rpm离心15min(CTAB配平,相对应的离心管,质量相差0.03g)。7、取上清(用剪过的枪头进行操作,过尖的枪头会把DNA链弄断。),加0.6倍体积的异丙醇,摇均(有絮状物析出,可放入4冰箱过夜)。8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出(DNA絮状物尽量要挑出,不要离心,
5、因为离心后虽然产量会增大,但是不完整的DNA也增多)(或4,10000 rpm离心5min,弃上清),放入新的离心管中,用70%乙醇漂洗2次,放置超净台中吹干。9、加入2ml 1TE缓冲液溶解,可放入4冰箱保存(酶活性在4或65水浴中最低,防止酶降解DNA)。10、未溶解的,可放入65水浴中促其溶解,10min后拿出冷却至室温,可重复,直至溶解。11、加入2.5ul RNaseA(RNaseA提前拿出融化),10离心,升至4000 rpm即停,使RNaseA和溶液充分混合。12、37水浴,保温1h。13、加入1ml Tris-苯酚、1ml氯仿异戊醇(241),摇均配平,4,11000 rpm离
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