最新发酵工程余龙江版第4章发酵工业无菌技术1幻灯片.ppt
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1、本章内容本章内容一、概念一、概念 二、发酵工业污染的防治策略二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备灭菌四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌五、空气除菌(3)不同发酵时期染菌对发酵的影响)不同发酵时期染菌对发酵的影响n种子扩大时期染菌种子扩大时期染菌: :n发酵前期染菌发酵前期染菌:n发酵中期染菌:挽救困难,应早发现,快处理发酵中期染菌:挽救困难,应早发现,快处理 ,处理方,处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵抗生素发酵 柠檬酸发酵柠檬酸发酵 a. 污染细菌:加大通风,加速产酸,调污染细菌:加
2、大通风,加速产酸,调pH3.0,抑制,抑制细菌细菌 b. 污染酵母:加入污染酵母:加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母;抑制酵母;通风加大,加速产酸。通风加大,加速产酸。 灭菌后弃去灭菌后弃去应迅速重新灭菌,补充必要的营养成分,重新接种应迅速重新灭菌,补充必要的营养成分,重新接种(3)不同发酵时期染菌对发酵的影响)不同发酵时期染菌对发酵的影响n柠檬酸发酵柠檬酸发酵c.染黄曲霉:加入另一罐将近发酵成熟的醪液,染黄曲霉:加入另一罐将近发酵成熟的醪液,pH下下降,黄曲霉自溶。降,黄曲霉自溶。 d.青霉菌:在青霉菌:在pH很低下能够生长。提前放罐。很低下能够生长。提前放罐。n发酵发酵后期
3、污染后期污染n染菌量不太多,可继续发酵染菌量不太多,可继续发酵n污染严重,则提前放罐污染严重,则提前放罐杀菌剂的添加:杀菌剂的添加:前期无必要,增加成本前期无必要,增加成本; 发现后加入,效果要具体评价发现后加入,效果要具体评价(4)杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响)杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响n丝状菌发酵被产酸菌污染:丝状菌发酵被产酸菌污染:pH不断下降,菌丝大量自不断下降,菌丝大量自溶,发酵液粘度增加,过滤困难溶,发酵液粘度增加,过滤困难 处理方法:处理方法:将发酵液加热后再加助滤剂;将发酵液加热后再加助滤剂;先加絮先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀凝剂使蛋白质凝聚后沉淀n杂菌分
4、泌较多蛋白质杂质时,对发酵后处理过程中采杂菌分泌较多蛋白质杂质时,对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间用溶媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间极易发生乳化极易发生乳化1. 染菌的检查与判断染菌的检查与判断n显微镜检查法显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需要一定时间n平板划线培养或斜面培养检查法:菌落平板划线培养或斜面培养检查法:菌落 噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑n肉汤培养检查法肉汤培养检查法 n发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断nDO2水平异常变化水平异常变化npH异常变化异常变化n尾气尾气CO2
5、异常变化异常变化 122. 污染原因分析污染原因分析 n主要原因:主要原因: 种子带菌种子带菌 无菌空气带菌无菌空气带菌 设备渗漏设备渗漏 灭菌不彻底灭菌不彻底 操作失误操作失误 技术管理不善技术管理不善n n从污染时间看:早期污染可能与从污染时间看:早期污染可能与接种操作接种操作不当有关;后期污染可能与不当有关;后期污染可能与及中间补料有关。及中间补料有关。n从杂菌种类看:从杂菌种类看:n耐热芽孢杆菌:与耐热芽孢杆菌:与有关有关n球菌、无芽孢杆菌:与球菌、无芽孢杆菌:与 有关有关n浅绿色菌落的杂菌:与水有关,即冷却盘管渗漏浅绿色菌落的杂菌:与水有关,即冷却盘管渗漏n霉菌:与霉菌:与有关,即无
6、菌室灭菌不彻底或操作问有关,即无菌室灭菌不彻底或操作问题题n酵母菌:糖液灭菌不彻底或放置时间较长酵母菌:糖液灭菌不彻底或放置时间较长 n从染菌幅度看:各个发酵罐或多数发酵罐染菌,且所从染菌幅度看:各个发酵罐或多数发酵罐染菌,且所污染的是同一种杂菌,一般是空气系统问题,若个别污染的是同一种杂菌,一般是空气系统问题,若个别罐连续染菌,一般是设备问题。罐连续染菌,一般是设备问题。2. 污染原因分析污染原因分析 3. 预防预防n种子带菌的防治种子带菌的防治 n灭菌彻底灭菌彻底n接种可靠:无菌室及设备可靠,无菌操作可接种可靠:无菌室及设备可靠,无菌操作可靠靠n保藏可靠保藏可靠n过滤空气带菌的防治过滤空气
7、带菌的防治n设备的渗漏或设备的渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治 “死角死角” n发酵罐的发酵罐的“死角死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件撑件 口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角” 消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装放汽边阀消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装放汽边阀n
8、管道安装不当或配置不合理形成的管道安装不当或配置不合理形成的“死角死角” 污水脓疱罐底 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角” 法兰连接不当造成的法兰连接不当造成的“死角死角” 灭菌时蒸汽不易通达的灭菌时蒸汽不易通达的“死角死角”及其消除方及其消除方法法n培养基与设备灭菌不彻底的防治培养基与设备灭菌不彻底的防治n原料性状:大颗粒的原料过筛除去。原料性状:大颗粒的原料过筛除去。 n实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。n灭菌过程中产生的泡沫造成染菌:添加消泡剂灭菌过程中产生的泡沫造成染菌:添加消泡剂 防止泡沫升顶防止泡沫升顶n连消不彻底连消不彻底
9、:最好采用自动控制装置:最好采用自动控制装置 n灭菌后期罐压骤变灭菌后期罐压骤变 n死角死角 n操作不当造成染菌操作不当造成染菌 n噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治 3. 预防预防采取哪些措施能够保持无菌发酵?采取哪些措施能够保持无菌发酵?n物料、培养基、中间补料要灭菌;物料、培养基、中间补料要灭菌;n发酵设备及辅助设备(空气过滤装置、各种发发酵设备及辅助设备(空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置)和管道要灭菌;酵罐进出口连接装置)和管道要灭菌;n好气发酵通入的空气要除菌;好气发酵通入的空气要除菌;n种子无污染;接种无菌操作过关种子无污染;接种无菌操作过关;n为了保持发酵的长期无菌状态,
10、需维持正压。为了保持发酵的长期无菌状态,需维持正压。http:/ n湿热灭菌法湿热灭菌法 n射线灭菌法射线灭菌法 n化学药剂灭菌法化学药剂灭菌法n过滤除菌法过滤除菌法n火焰灭菌法火焰灭菌法 http:/ (一)湿热灭菌原理(一)湿热灭菌原理 (二)分批灭菌(实罐灭菌)(二)分批灭菌(实罐灭菌) (三)连续灭菌(连消)(三)连续灭菌(连消)(四)分批灭菌与连续灭菌的比较(四)分批灭菌与连续灭菌的比较 1. 热阻热阻2. 微生物热死定律:对数残留定律微生物热死定律:对数残留定律3.灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素 (一)湿热灭菌原理(
11、一)湿热灭菌原理1. 热阻热阻 n定义:定义:微生物对热的抵抗力称为热阻,可用比死微生物对热的抵抗力称为热阻,可用比死亡速率常数亡速率常数k来表示来表示 。 k,热阻热阻, tkNdtdNktNNt0lnn当温度当温度T一定时,一定时,k随微生物不同而不同,具体随微生物不同而不同,具体计算时,可取细菌芽孢的计算时,可取细菌芽孢的k值为标准。值为标准。n当当 T 变化时,变化时,k有很大变化,其变化遵从阿累有很大变化,其变化遵从阿累尼乌斯定律尼乌斯定律 k=Aexp(- E/RT) k与微生物活化能及与微生物活化能及T有关有关 1. 热阻热阻 大肠杆菌在不同温度下大肠杆菌在不同温度下的残留曲线的
12、残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线温度下的死亡曲线 http:/ 微生物热死定律:微生物热死定律:(1) 对数残留定律对数残留定律n在一定温度下,微生物在一定温度下,微生物受热致死受热致死遵循分子反应速度理论,遵循分子反应速度理论,微生物受热死亡的速率微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数与任何瞬间残留的活菌数N成正比,即成正比,即 当当Nt=0时,时, t=, 既无意义,也不可能。既无意义,也不可能。 一般采用一般采用Nt=0.001,即即1000次灭菌中只有一次失败次灭菌中只有一次失败。kNdtdNktNNt0lntNNkt0log
13、/303. 2http:/ 非对数残留定律非对数残留定律 n某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律:如一些某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律:如一些微生物芽孢。微生物芽孢。 kR ksNR Ns NDdNR/dt=-kR NRdNs/dt =kR NR -ks Ns Nt/N0=KR/(kR-kS) ekst-ks/kR e-kRt 式中式中NR:耐热性活芽孢数;耐热性活芽孢数;Ns:敏感性活芽孢数敏感性活芽孢数 ND:死亡的芽孢数死亡的芽孢数;kR:耐热性芽孢的比死亡速率耐热性芽孢的比死亡速率; ks:敏感性芽孢的比死亡速率;敏感性芽孢的比死亡速率; N0:初始活芽孢数。初始活芽
14、孢数。n培养基中含有大量的不耐热的微生物和培养基中含有大量的不耐热的微生物和相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留曲线曲线 在在T相同时,对数与非对数定律的灭菌相同时,对数与非对数定律的灭菌时间时间t不同。不同。3. 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 n培养物质受热破坏也可看作一级反应:培养物质受热破坏也可看作一级反应:式中式中C:对热不稳定物质的浓度;对热不稳定物质的浓度;k:分解速度常数分解速度常数; k的变化也遵循阿累尼乌斯方程:的变化也遵循阿累尼乌斯方程: 都与相应的活化能及都与相应的活化能及T有关有关CkdtdC)exp(RTEAk)exp(RT
15、EAk当当T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE) 随着随着T上升,菌死亡速率增加倍数大于上升,菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数,故一般培养基成分分解速率增加倍数,故一般选择高温快速灭菌选择高温快速灭菌 。 3. 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素 n培养基成分培养基成分n油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性物等增加微生物的耐热性n低浓度(低浓度(1%-2%)NaCl对微生物有保护作用,对微生物有保护作用,随着浓度增加,保护作用减
16、弱,当浓度达随着浓度增加,保护作用减弱,当浓度达8%-10%以上,则减弱微生物的耐热性。以上,则减弱微生物的耐热性。npH:pH6.0-8.0,微生物最耐热,微生物最耐热,pH6.0,H+易渗入微生物细胞内,改变细胞的生理反应促易渗入微生物细胞内,改变细胞的生理反应促使其死亡。使其死亡。培养基培养基pH愈低,灭菌所需时间愈愈低,灭菌所需时间愈短。短。n培养基的物理状态培养基的物理状态n泡沫:泡沫中的空气形成隔热层,对灭菌极为泡沫:泡沫中的空气形成隔热层,对灭菌极为不利,可加入少量消泡剂不利,可加入少量消泡剂 。n培养基中的微生物数量培养基中的微生物数量4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭
17、菌的其它因素 分空气过滤器灭菌分空气过滤器灭菌并用空气吹干并用空气吹干夹套或蛇管排冷水,开启排夹套或蛇管排冷水,开启排气管阀,空气管通蒸汽,也气管阀,空气管通蒸汽,也可夹套内通蒸汽可夹套内通蒸汽达达70左右左右取样管取样管放料管放料管通蒸汽通蒸汽120,1105pa保温保温保温阶段,凡液面以下各管保温阶段,凡液面以下各管道都应通蒸汽,液面上其余道都应通蒸汽,液面上其余各管道则应排蒸汽,不留死各管道则应排蒸汽,不留死角,维持压力、温度恒定角,维持压力、温度恒定罐压接近空气压力罐压接近空气压力向罐内通无菌空气向罐内通无菌空气保温结束,依次关闭保温结束,依次关闭各排汽、进汽阀门各排汽、进汽阀门夹套或
18、蛇管中通冷水夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度培养基降温到所需温度(二)分批灭菌(实罐灭菌)(二)分批灭菌(实罐灭菌) 1.灭菌工艺过程灭菌工艺过程n升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果,考虑升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果,考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行,故可以到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行,故可以简单地利用式简单地利用式 (N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。来粗略估算灭菌所需时间。2. 灭菌时间的估算灭菌时间的估算2. 灭菌时间的估算灭菌时间的估算n例例1:有一发酵罐内装:有一发酵罐内装40m3培养基,在培养基,在1210C温度下实温度下实罐灭菌,原污染程度为每罐
19、灭菌,原污染程度为每1ml有有2105个耐热细菌芽孢,个耐热细菌芽孢,已知已知1210C时灭菌速度常数时灭菌速度常数k=1.8min-1,求灭菌失败机,求灭菌失败机率为率为0.001时所需时间。时所需时间。 解解:N0=401062105=81012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭,特别是当培由于升温阶段就有部分菌被杀灭,特别是当培 养基加热至养基加热至1000C以上,这个作用较为显著,以上,这个作用较为显著, 故实际
20、保温阶段时间比计算值要短。故实际保温阶段时间比计算值要短。n (三)连续灭菌(连消)(三)连续灭菌(连消)n工艺流程工艺流程n喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程n喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 n薄板式换热器连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程 n灭菌时间的计算灭菌时间的计算 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中:式中:C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。的含菌数。 n例例2某发酵罐内装某发酵罐内装40m3培养基,采用连续灭菌,培养基,采用连续灭菌,灭菌温度为灭菌温度为1310C,原污染程度为每,原污染程
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