实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切.ppt

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1、实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切,实验原理,限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。,限制性内切酶可分为三类,类限制性内切酶,类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如Sma: 5-CCCGGG-3)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5,实验材料和试剂,实验材料： 玉米基因组DNA 实验试剂： BamH I 酶及其酶切缓冲液：购

2、买成品。 SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。,实验仪器,恒温水浴锅,用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底,混匀反应体系后，37水浴保温2-3h,电泳检测,EP管编号,实验步骤,反应体系 20L酶液 DNA 15L BamH 1L Sal 1L 10BufferT 3L,对质粒DNA酶切反应,限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶, 消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。,电泳检测示例,实验注意事项,限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。,思考题,如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？,