低收入国家结核病细菌学检测的优先领域.doc

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1、低收入国家结核病细菌学检测的优先领域第二版2007Hans L. RiederArmand Van DeunKai Man KamSang Jae KimT. Martin ChondeArnaud TrbucqRichard UrbanczikIUATLD法国，巴黎，68 boulevard Saint Michel, 75006 Paris, France本书出版得益于挪威发展合作部的大力支持编辑：IUATLD68 Boulevard Saint-Michel, 75006 Paris, France作者：Hans L. Rieder, Armand Van Deun, Kai Man K

2、am,Sang Jae Kim, T. Martin Chonde, Arnaud Trbucq, Richard UrbanczikIUATLD2007年2月版权保留未经作者或出版商许可，任何个人或单位不可转载本书中的任何内容。ISBN : 2-914365-29-2前言（第一版）写作本书之际，在全世界许多地区尤其是一些低收入国家，结核病仍然是严重的公共卫生问题。由于实施了有效的控制策略，结核病控制取得了进展；但仍有许多国家不能充分意识到结核病控制的重要性和优先性。结核病细菌学检测是结核病控制的基本组成部分，用于发现传染源，诊断临床可疑症状者，随访监测疗效。要实施这些职能，一个组织良好的能够

3、进行结核病细菌学检测的实验室网络是必不可少的。实验室网络能够提供有价值的信息以评价国家结核病控制规划的执行能力和影响力，鉴别需要改进的地方，制定治疗政策。基于以上原因，必须确保有一个可靠的、有能力的参比实验室，不仅用于督导实验室网络而且还要制定实验室标准和政策.无论作为中央公共卫生实验室的一部分还是国家结核病研究所中的实验室，国家结核病参比实验都应该是结核病实验室网络中的顶级实验室，以便作为结核病控制规划中的参比实验室。参比实验室在以下活动的组织和实施中发挥着重要的作用，制定指南、保证高质量、标准化痰涂片镜检的实施、监督对实验室人员的培训、耐药监测、参与流行病学和实施性研究、以及确保耗材的供应

4、和优化报告系统。参比实验室还应该有足够的能力承担培养和药物敏感试验。l 本书为国家参比实验室的负责人在以下几方面提供了实用的指导：痰涂片镜检和耐药监测中参比实验室的作用、主要职责、技术、组织管理。需要指出的是，质量保证和质量控制、培训、督导是实验室最基本的功能，虽然本书主要阐述结核病，但是同样的原则也适用于其他的疾病。因此，本书将是国家参比实验室和国家结核病控制规划专家的一个非常受欢迎的参考资料的补充。在此，我祝贺各位作者，因为他们的这些努力，将会在结核病控制一个重要领域满足实际的需要。Dr Arata KochiDirector, Global Tuberculosis Programme世

5、界卫生组织l 致谢本书第一版非常感谢Thuridur Arnadottir, Chris Collins, Etienne Declercq, Donald Enarson, Isabel de Kantor, Nico Nagelkerke and Beat Neuenschwander提供的意见和建议。Edik Balaian制备手绘图画，Helge Myking制作了建筑图，Hanne Hemsen帮助修订图纸。Fadila Boulahbal和Jacques Grosset对于塞内加尔达喀尔的参比实验室的设计作出了极大贡献，这对于本书有重要影响。本书作者非常感谢Adalbert Las

6、zlo，他在第一版中提供了相关的建议，而且其中的大部分内容包含在第二版中。Donald Enarson浏览了第二版的手稿，提出了许多重要的、中肯的意见和建议，这对于整个内容以及整个流程的改进有巨大的帮助。另外，在最终的修订中他还提供了许多宝贵的经验。还要感谢Ivan Bastian 和Richard Lumb，他们从头至尾的看了原稿，提出了许多意见。还要感谢Thuridur ，Arnadottir，它对于许多概念提出了改进。最后还要感谢Abigail Wright，他做了很多重要的注解。前言（第二版）本书第一版的名称为“低收入国家公共卫生服务国家结核病参比实验室和全国实验室网络的基本要求和服务

7、”。作者希望“低收入国家结核病细菌学服务的优先领域”（简称为“红皮书”）这个更加简明的题目能够体现第二版中的修定。Helge Myking（第一版中的作者）在本书印刷之前刚去世，他为塞内加尔国家结核病控制规划中建立国家结核病参比实验室提供了建筑技术支持。本书中描述了他在那个项目中取得经验。由Helge书写的章节和构架未加改动的保留下来。我们将此书的第二版献给Helge Myking。l 这本书源于我们多个国家合作者对需求的增值。我们首先也是最重要的要感谢低收入国家的大量的基层实验室的技术人员，他们与我们分享了问题和新的解决方法，他们还多次表达了对来源于中间级实验室，甚至是国家结核病参比实验室技

8、术及精神方面的支持的需求。因此本书列出了实验室网络中各级职责的提纲，以及国家参比实验室作为全国实验室网络中的顶级实验室，这些都建立在国家结核病控制规划公共卫生优先领域工作框架下的。本书主要献给那些低收入国家的偏远的农村地区的技术人员，正是这些人员的常规工作为结核病控制的成功贡献了力量。关于分枝杆菌细菌学有许多非常优秀的书。本书的目的不在于简单的再增加一本这样的书，而是要作为现有书目的补充。本书的范围和重点存在着局限性，因为它的目的不在于囊括分枝杆菌细菌学所有的领域，相反是将重点放在每一级别实验室的最低需求这一特定的部分，并且强调国家结核病参比实验室的职责。例如，培养只作为耐药监测中药敏试验的前

9、提讨论。培养作为敏感度较高的诊断病人的方法也涉及到，但是实际应用常常存在着困难，在低收入国家NTP中不能作为常规诊断方法使用。同样，菌种鉴定只讨论从环境中的分枝杆菌中区分致病菌种结核分枝杆菌复合群，而没有将重点放在如何从环境中鉴别分枝杆菌。写本书时，作者特别注意到WHO和IUATLD的出版物。本书尽量与官方推荐的内容保持一致，但是由于科学不断发展，新知识的不断出现，很显然现存的某些概念受到挑战，早在1998年的第一版中已经出现过类似问题，我们知道本版也会有类似问题。然而在我们引入新概念时我们会标注清楚，并且我们有足够的科学证据支持这些概念。尽管本书出现的大部分材料已经在现场检验过而且被证明是合

10、适的，但是不可避免还是有一些观点需要进一步的进行现场验证。本书作者欢迎来自于各方面的意见和评论，这些意见和评论将有助于在未来的新版本中改进某些内容。Paris, Antwerp, Hong Kong, Seoul, Dar es Salaam,Paris and Schomberg2006年12月目录第一章.国家结核病实验室网络的职责和人员配置A.基层实验室的职责和人员配置要求B.中间级实验室的职责和人员配置要求C.国家结核病参比实验室的职责D.国家结核病参比实验室的人员配置和工作日要求第二章.痰涂片镜检A.收集痰标本B.痰涂片镜检申请C.制备痰涂片、染色D.显微镜检查E.痰涂片检查结果的登记

11、与报告第三章.痰涂片镜检的培训和质量保证A.实验员的培训B.痰涂片显微镜检查的质量保证第四章.抗结核药物耐药监测A.监测的目的和培养的作用B.实验室方面的注意事项C.耐药监测中特殊的技术D.耐药监测中需要考虑的伦理学方面第五章.国家结核病实验室网络中需要的方法、材料、设备以及物理环境A.基层实验室的设计B.国家结核病参比实验室的设计C.国家结核病参比实验室的建筑D.基层实验室痰涂片镜检的物资管理E.国家结核病参比实验室需要的耗材F.实验室中需要特殊考虑的生物安全G. 含有结核分枝杆菌复合群的培养物运输的国际规定第六章.附件附件1 痰涂片镜检化验单和报告单附件2 痰涂片镜检的实验室登记附件3 基

12、层实验室痰涂片镜检的报告表格、库存情况附件4 痰涂片镜检批量测试表格（涂片由上级实验室下发到下级实验室）附件5 痰涂片镜检盲法复检表格（涂片由下级实验室上送上级实验室）附件6 以区域为单位复检结果的汇总报告附件7 培养实验室登记本附件8 菌种鉴定和药敏试验登记本附件9 痰培养实验室申请单及报告单附件10 药敏试验结果汇总报告格式附件11 基层实验室设计附件12 国家结核病参比实验室的设计和图纸图1 计划A 地点和位置设计图图2 计划B 实验室四周图图3 计划3 实验室详细布局图4.实验室气流控制示意图附件13 以区域为单位痰涂片镜检耗材的报告和申请表格第一章 全国结核病实验室网络的职责和人员配

13、置每个国家卫生服务体系的构成及其实验室服务的构成各不相同。然而，一个国家的实验室网络总是作为综合性卫生服务的一部分，在基层、中间级以及国家级提供服务。在国家水平，实验室服务中往往有一些特别之处，其中之一就是结核病实验室工作。与结核病实验室服务一样，全国实验室网络通常有一个系统，这个系统能够确保整个网络实验室（不论是综合性还是专科性）中的实验员的培训和工作熟练度。正如本章所述，国家结核病控制规划必须与实验室合作并给予资源上的支持，确保各个水平实验室保持痰涂片显微镜检查的熟练度、改进涂片镜检质量。A. 基层实验室的职责和人员配置要求最基层的执行国家结核病控制规划的是管理单位（unit of man

14、agement），他们将提供结核病的诊断、治疗服务（综合性医疗服务的一部分），登记用于规划效果评估、监测和计划耗材供应的最重要的信息。每个单位一般覆盖人口为50,000-150,000，但是应该依据发病率、人口密度、医疗服务的可及性以及其他独特的地方因素加以调整。l 诊断工作需要门诊医生能从到卫生机构（即各地的每一个卫生服务点）就诊的所有人群中鉴别出结核可疑者，实验室人员能够提供熟练的抗酸染色镜检服务。过于分散化的涂片镜检实验室不能保证实验室人员的熟练度，另外因开展质量保障、设备和耗材提供等活动也需要更高的难以实现的投入。过于集中化的涂片镜检又将影响服务的可及性，并且可能因为实验员的负担过重影

15、响镜检的质量。因此，涂片镜检单位的设置与分布既应考虑到资源的因素（特别是督导）还要考虑到人群的可及性。基层镜检实验室的最重要的任务是用萋-尼氏法进行痰标本的抗酸染色镜检。其中包括室内质量控制，还要接受中间级实验室的常规督导和EQA。另外，实验员还要负责维护显微镜，使之处于良好的功能状态，并且延长显微镜的使用寿命。室验室人员要及时向开具申请单的门诊医生报告涂片镜检结果，并在全国通用的标准的实验室登记本上仔细登记。实验室登记本是最重要的信息来源，用于回顾总结已经开展的活动，为计算各种指标、评估活动开展的效果提供信息。同样实验室登记本还用于EQA随机抽片。基层实验室通常有1个或者2个工作人员。这些人

16、员除了涂片镜检外常常还有其他的额外工作，因此必须考虑实验员的工作负担不能太大否则会影响镜检的质量。每天每人的最大工作量应为20-25个标本。如果工作量经常性的超出此数值，那么需要增加人员。B.中级实验室的职责和人员配置要求中级实验室，正如名称所讲作为基层实验室和国家实验室的重要联结纽带。通常，这一级别的实验室位于较大的区域性或者省级医院，而且往往配备有几个多职能的人员。中级实验室的工作除了为所辖的地区提供常规服务外，主要任务是为基层实验室提供支持。这种支持包括配制分发试剂、耗材（玻片、痰盒等必需品），确保基层实验室能够不间断的提供服务。重要的是，中级实验室对基层实验室支持的应包括定期现场督导、

17、回顾总结开展的活动、发现遇到的问题，并且及时将室间质量控制结果反馈到基层实验室。这将极大的鼓舞基层实验室人员，因为他们工作相对独立很少有机会与上一级的人员讨论技术或者其他问题。l 反过来，中间级实验室接受国家实验室提供的支持，通过与国家级实验室协作确保实验室网络中的各个环节能够顺利运作。中间级实验室是国家政策和指南贯彻执行的最重要的部分。确保所有过程在整个国家统一的执行。l 中间级实验室负责基层实验室的室间质量保证工作，并将结果反馈到基层实验室，还要向国家实验室提供相关的结果和信息。C.国家结核病参比实验室的职责低收入国家NTP的中心任务就是通过痰涂片发现病人并给予有效的化学治疗。国家结核病参

18、比实验室应通过全国的实验室网络，优先开展用于支持这个目的的活动。因此国家结核病参比实验室的主要任务包括：l 确保基层单位在常规的镜检中保持高水平的熟练度l 在全国范围内推行标准化操作l 组织、协调实验室网络中的培训l 组织实验室网络中用于涂片镜检的质量保证的检测l 开展耐药监测l 开展实施性研究很显然，国家结核病参比实验室很少开展全国范围内的培训、督导以及涂片镜检的熟练度测试，这也不是最有效的利用资源的方式。但是，国家结核病参比实验室总的职责是制定标准、评估政策的执行情况。将某些活动分散化是很有必要的，国家参比实验室可以鼓励中间级实验室参与全国实验室网络中的重要的任务。长远来看，有效的分散化以

19、便越来越有效率的为NTP提供支持是很有必要的。1 保持常规涂片镜检的熟练度全国范围内都可以得到涂片镜检服务，因为它主要依赖于多功能的显微镜，这在一般的医疗服务体系中都可以得到。图I.1显示了各种用于鉴别肺结核的方法的敏感性。以菌的数量为基础估计了各种方法的相对检出频率。在发达国家，或者是在主动发现病人时，往往遇到的是处于疾病早期阶段的病人，只有很小比例病人涂片阳性。在所有的诊断方法中，临床症状和胸片的检查是最敏感的工具，当然要牺牲特异性。Figure I.1 通过检测痰标本中菌数量的多少显示了不同的方法在诊断肺结核时的效果。在熟练的或者有经验的实验室，每毫升痰标本10个菌即可以通过培养方法检测

20、到。培养方法可能由于标本的运送时间、前处理的方法、离心及其他必要的步骤的不同影响其固有的敏感性。分枝杆菌活性的降低是不可避免的。核酸扩增技术可以检测到每毫升标本中含有100个菌。该方法的一个优势是不需要活菌，因为死菌同样含有靶核酸。为了成功地得到可靠的核酸扩增试验的结果，需要配备专用的房屋、设备以及训练有素的人员注意各个细节，而且需要比涂片和培养更多的费用。而且，核酸扩增阳性结果并不能有分离物用于菌种鉴定和药敏试验。涂片镜检的局限性（推荐检测100个油镜视野）在于需要大量的菌才能检测到，每毫升痰标本中有1，000个以上菌有60%的机会检测到，每毫升标本中有10，000个以上菌则有95%的机会检

21、测到。即使是镜检技术较差，每毫升标本中有30，000-60，000个菌往往也可以检测到。相对于培养来说，涂片镜检在诊断肺结核方面敏感性较差，但是在筛查接触者鉴别可疑传染源菌时高度敏感(Figure I.2)。从公共卫生奖，涂片镜检的目的是最大限度发现传染源，确保实验室保持最高的熟练度。l 国家结核病参比实验室的主要任务是确保全国实验室网络工作的质量。为了保持能力和可信性，国家实验室必须具备基层实验室各种工作活动的熟练度，也就是说国家实验室应该常规检测从下级实验室送来的需要验证的标本。为了维持细菌学诊断的能力，必须有一定数量的阳性结果。联合国合作项目已有的经验表明，初诊查痰病人的痰涂片镜检的平均

22、阳性率为15%，但是范围从5%到30%不等。如果推荐初诊可疑者查3份痰，结核病人随访查痰3次，发现每个涂阳病人需要检查的涂片是(3/0.15)+3，即23张。对于每个病人来说，需2张阳性涂片作为诊断。随访阶段，每10个病人中有1个病人在治疗2个月时涂片阳性。这相当于每个病人有2.1个涂片阳性。以每天的工作量为20-25张计算，如果是全职每年的工作量为6000张涂片，包括500张多阳性片。如果每周能够检测1-2张阳性片仍然能够保证熟练度，但是没有一个确切的确保熟练度的最低的数量限制。国家结核病参比实验室也许会冒着这样的风险，即日常工作量过大，而不能完成最主要的任务包括质量保证、培训和督导。当每天

23、的工作量超过30张时推荐用荧光染色方法。尽管这种方法很吸引人，但是仅仅使用这种方法是不明智的，因为萋-尼氏方法的熟练度必须保证。无论选择哪种方法，萋尼氏方法都要坚持应用即使每日的工作量很大（这种情况下仅有一部分的涂片用萋尼氏方法）。参比实验室提供的服务应该与综合性医疗机构提供的一样，因为要对工作人员提供持续不断的培训。实验员必须能够得到在日常工作中经常遇到的问题相关的培训。国家实验室通过复检涂片（第二复检者）维持萋-尼氏染色方法熟练度。如果日常工作量太大，应该将一些工作分担给其他中心或者实验室，以便保证将主要精力放在最优先的工作领域。2 基层实验室痰涂片的培训和质量保证质量保证：持续提高实验室

24、服务的可靠性和有效性的体系。包括3个组成部分：l 质量控制（QC,也称为室内质量保证）：控制涂片镜检实验室的操作包括设备检测以及每批新染液的检测的所有方法。l 室间质量评估：(QA)通过批量测试和盲法复检，通过将被评估实验室的结果与网络中的其他实验室（中间级实验室或者国家实验室）的结果相比较而评估该实验室的能力。室间质量评估还包括现场评价操作的质量、现场阅读片子。l 质量提高（QI）：分析痰涂片镜检诊断服务的各个方面，旨在永久改善不足的地方的过程。资料收集、资料分析、创造性地解决问题是质量提高的核心部分。包括连续性的监测，发现不足，提出整改措施（如需要时再培训防止错误的重复发生）。质量改进经常

25、依赖于有效的现场评估。痰涂片实验员的培训必须与日常工作相关。培训的主要目的是加强实验员在常规应用的技术方面的熟练度，因此理论的讲解应尽量的少，培训的三分之二时间（通常培训的时间为5天）应该用于现场实习。国家实验室应该确保基层实验室提供的痰涂片镜检服务按照标准化操作程序进行并且有高水平的熟练度。这就意味着国家级实验室主任必须详细制定督导地区级以及所辖市、县的年计划。这些督导最好与NTP一起。这种督导提供了全程督导日常工作的机会。尽管直接督导是最重要的质量保证的方式，但是必须建立正式的痰涂片镜检的室间质量评估体系。这个体系的主要目的是维持和持续提高痰涂片镜检服务的质量。为了确保室检质量评估能够覆盖

26、全国，中间级实验室积极参与到EQA中是非常重要的，因为直接国家级实验室直接与基层实验室相联系是不可行的也是不必要的。只有实验室和NTP有效的合作，在整个国家EQA才可能有效地执行。EQA需要到基层实验室抽片并将结果及时反馈给基层实验室。如果没有规划的人员，EQA也不可能在全部的规划单位开展。如果想EQA成功实施，规划人员必须参与抽片并提供结果反馈。3 耐药监测耐药监测是国家结核病参比实验室的主要任务之一。在任何地方，耐药监测都是很复杂的，需要： l 理解有代表性的抽样以及抽样对于获得有意义结果的重要性l 构建规划活动与实验室网络的密切合作机制l 确保质量合格的痰标本和适宜的标本运输条件l 痰标

27、本匀化、前处理、接种、培养结果判读和菌种鉴定的技术能力l 药敏试验的熟练度l 室内质量保证和室间质量评估的体系本书旨在促进规划管理者和实验室专家的合作，以获得一个有效地对当地耐药的评估。D.国家结核病参比实验室的人员配置和工作日为了确保更好地开展工作，国家实验室必须有足够的人员。对于一个小国家来说，实验时的最低人员数量要求如下：l 实验室负责人 1人l 实验室负责人高级专业代表 1人l 涂片镜检实验员 2人l 培养相关实验员 2人（轮流，负责制备培养基、接种、药敏试验、结果判读）l 洗刷、清洁 1人（高压、洗刷、废弃物处理）一旦工作量增加要相应的增加员工的数量。实验室负责人负责整个实验室的运作

28、并且与NTP密切合作，执行国家结核病控制的各项重要工作。尤其重要的是参比实验室的职责要优先。理想状况下，实验室负责人的资质应该拥有微生物学、医学或者相关专业的博士学位。实验室负责人应该具备高水平的组织、协调、执行各种任务的能力。实验室负责人高级代表应该有足够的能力承担实验室内相关的各种各样的活动，实验室负责人不在时应该承担相应的职责。具有的资质与试验室负责人应该是相同的，但是在专业自治方面可以稍逊一筹.l 参比实验室中的训练有素的技术人员应该在光学和荧光显微镜中都具备相应的知识。这对于确保高质量的常规服务、提供培训、协助涂片镜检的EQA都是重要的。l 为了确保和维持高水平的标准培养和药敏试验技

29、术的熟练度，必须由2个人员负责该项工作。l 需要一个全职的人员负责污染物的消毒、洗刷、日常的实验室清洁。l 应该避免不同国家级参比室之间实验室的人员进行轮转，这样会导致工作效率很低。参考书目1. Aziz M A, Ba F, Becx-Bleumink M, Bretzel G, Humes R, Iademarco M F, et al. Externalquality assessment for AFB smear microscopy. In: Ridderhof J, Humes R, Boulahbal F, eds.Washington, DC, USA: Associatio

30、n of Public Health Laboratories, 2002.2. Collins C H, Grange J M, Yates M D. Tuberculosis bacteriology. Organization and practice.Second edition. Oxford, UK: Butterworth-Heinemann, 1997.3. Enarson D A, Rieder H L, Arnadottir T, Trbucq A. Management of tuberculosis. A guide forlow income countries. F

31、ifth edition. Paris, France: International Union Against Tuberculosisand Lung Disease, 2000.4. International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Technical guide. Sputumexamination for tuberculosis by direct microscopy in low income countries. Paris, France:International Union Against Tuberc

32、ulosis and Lung Disease, 2000.5. World Health Organization. Treatment of tuberculosis: guidelines for national programmes.Third edition. WHO/CDS/TB/2003.313:1-108. Geneva, Switzerland: WHO, 2003.6. World Health Organization. The WHO/IUATLD Global Project on Antituberculosis DrugResistance Surveillan

33、ce. Antituberculosis drug resistance in the world. Report No. 3. Geneva,Switzerland: WHO, 2004. WHO/CDS/TB/2004.343:1-129.7. World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organizationand management. Geneva, Switzerland: WHO, 1998.8. World Health Organization. Labora

34、tory services in tuberculosis control. Part II: Microscopy.Geneva, Switzerland: WHO, 1998.9. World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture.Geneva, Switzerland: WHO, 1998.第二章 痰涂片镜检Robert Koch在1882年首次发表文章发现结核病的致病菌时，已经描述了染色和培养的方法。Robert Koch的染色方法使用初染液和媒染剂（使染色

35、剂更好的渗透入富含脂质的细胞壁）、脱色剂、复染剂。这样做的原因是脂质是疏水性的，染液很难渗透入细胞壁内。Robert Koch使用甲基篮作为初染液，氢氧化钾溶液作为媒染剂。他没有用脱色剂而使用vesuvium即作为脱色剂又作为复染剂。Ehrlich提出用复红作为初染液，碱性胺作为媒染剂。他还提出硝酸作为脱色剂，如果初染液是红色（如复红）的应该用蓝色背景。Ziehl对媒染剂提出了质疑，他建议用苯酚。Neelsen将所有好的方面结合起来，他建议使用Ehrlich的初染液，但建议使用Neelsen提出的媒染剂（苯酚），脱色剂由硝酸改为硫酸，这也就是Ziehl-Neelsen染色方法的基础，诞生于18

36、82年。涂片阳性的病人是可能性最大的传染源。涂片镜检的敏感度对于诊断肺结核还远远不够完美。如果技术娴熟，在患病率高的国家大约有三分之二的最终培养证实阳性的病人可以通过涂片镜检发现。但是这种比例在合并感染HIV的病人中会低很多,在儿童检出率也大大降低。然而，涂片镜检在发现传染源方面的敏感度超过80%，无论是在什么情况下，涂片阳性的病人相对于阴性的病人讲更容易传播结核菌。因此，痰涂片镜检在国家结核病控制规划中是最有效的、效率最高的病人发现的方法。这种方法发现结核病控制中最应优先发现的病人。而且，痰涂片镜检在发现抗酸菌方面有很高的特异性，在患病率高的国家几乎总是能够诊断结核病人。而且，这种方法提供了

37、一种非常快速的诊断方法。在患病率高的国家，任何级别的实验室的任何一个医务人员借助于一台多用途的设备即可开展涂片镜检。正因为如此，痰涂片镜检是结核病控制中的最基础的诊断方法.A.痰标本收集无论对病人还是对于实验室人员,痰标本的收集应做到尽可能的便捷有效。诸多研究表明，检出病例的增加幅度随着连续收集的标本而降低。大多数国家采用WHO和联合国推荐的收集三份痰标本作为发现传染性肺结核病人的最佳方法。在最终痰涂片阳性的病人中大约80%在第一份痰是阳性，15%在第二份痰是阳性，另外5%在第三份痰是阳性。然而，最近的几个研究显示依赖第三份痰检出阳性的只占1%-3%，这样为进一步发现剩余的病人而增加了大量的工

38、作量。需要多少张片子才能再进一步发现一个病人取决于可疑者中的患病率和涂片镜检的阳性检出的增加幅度。例如，如果可疑者中的阳性病人患病率为10%，依赖第三份痰标本检出阳性的比率为5%，那么依赖第三份痰标本（前两份标本为阴性）发现一个病人需要镜检的片数为1/（0.1*0.5）或者200张，这是8-10天的工作量。如果第三份痰标本检出的阳性比率更低，则需要的工作量相应加倍。由于在HIV高流行国家实验室涂片镜检的工作量急剧增长，因此在这样的地域正在考虑是否可以采用收集两份痰标本用于诊断的政策。涂片镜检的低敏感性正在不断地被指责，一些更加敏感的方法（但是很复杂同时耗费大量的劳动）正在被广泛应用。每个国家应

39、该考虑到每份痰标本的阳性检出的增加幅度，因地制宜的制定自己的政策：l 如果人员足够或者荧光染色镜检能够为大量的痰标本提供准确的结果，应该检测三份（或者更多）痰标本以增加敏感性。在病人在病程的较早阶段就诊时，这种方法尤其很好，因为痰标本中的菌并不是匀质存在的。l 依赖第三份痰标本检出阳性的比率低时，检测两份痰标本（间隔1-2周）对于诊断来说是非常有效的（尽管应用了用于其他感染的抗生素但是症状仍未改善）。这也许也是最敏感的策略，特别是在由于工作量过大引起镜检质量差的地域。推荐的采集三份痰标本（第一次就诊时采集第一份，次日清晨采集第二份，病人将第二份标本送来时采集第三份痰标本，即所谓的即时谈-晨痰-

40、即时痰）是介于最佳阳性检出率（晨痰）和方便病人（即时痰）两者中间的一个折中的方法。采集三份晨痰以获得最佳的涂片阳性检出率不太切合实际，因为这需要病人多次到医疗机构（4次）。如果收集的都是晨痰，则第一份痰标本检出阳性的占95%，原因是即时痰的质量往往较晨痰质量差。另外，在HIV高流行地区由于工作量的增加，可能只对第一份痰标本给予足够的重视和耐心的检查。病情严重的门诊病人应该收集即时痰并给予立即检查，而住院的可疑结核病人应该连续收集三天的晨痰，而不是敏感度较低的即时痰-晨痰-即时痰。当前推荐的阳性结核病人的定义是有两份痰标本阳性，争论的主要焦点是第二份痰标本是否需要，这用于排除由于标本的交叉污染引

41、起的假阳性。基层实验室这种错误发生的几率知之甚少。然而，仅有的几项研究表明发生假阳性（包括技术错误和判读错误）的频率只有1%-2%。通过室间质量评估抽取报告阳性的涂片（以自然发生的阳性率）可发现这样的问题。一旦发生这样的问题，应该足够的重视而且必须进一步跟踪随访而不必考虑统计学意义。在患病率高的国家，与其他的标准的诊断方法如胸片检查、培养（交叉污染比较常见）相比，抗酸染色的极高的特异性仅仅由于偶尔的行政错误会降低。需要第二个阳性结果的原因是为了进一步证实，如果能够保证完全正确的技术操作，那么这只是为了增加严谨性而不是必需的（参照第三章）。任何情况下，得到一个阳性结果后要立即开始治疗，不要因为等

42、待第二个阳性结果而耽误治疗，因为第二个阳性结果的目的不是为了指导治疗而只是区分病人是涂阳还是涂阴。痰标本的质量是非常重要的。必须鼓励病人耐心的从肺部深处咳痰。即使这样，一些研究表明即使主要是口水痰也有可能检出菌，只是菌量很少。因此所有的痰标本都要进行镜检，如果没有其他的痰标本即使是看起来像口水痰的痰标本也要镜检，如正在接受治疗的病人。什么样的口水痰标本有现实操作意义，很难给出一个确切的定义。为了记录常规标本的质量，往往用肉眼区分。这也许不是十分的准确，但是很有实际意义。主要将痰标本分为口水、粘液痰、脓痰、粘脓痰。按照这种分类，口水痰标本的特征是水性的，而没有粘液或者脓性的部分。更精确的方法是应

43、用痰细胞学，即计数每个低倍视野下（100x）白细胞和上皮细胞的数量。如果白细胞与上皮细胞数量之比小于1，那么这份标本含有大量口水痰的可能性增加，然而只要有白细胞存在，获得阳性镜检结果或者阳性培养结果的可能性还是很大的。B.申请痰涂片镜检对于痰标本的镜检，标本收集与染色之间的间隔不是特别重要。因此，标本或者痰膜可以送到距离较远的实验室进行镜检而不影响准确率。然而，大多数的国家采用送病人到最近的痰检点的策略，因为尽管理论上讲送标本或者痰膜对于病人来说很方便，但是这样的策略在实际上是很难有效的实施的。运输固定的痰膜而不是痰标本也许是更容易的方法，但是这需要额外的培训和用于制备痰膜的简易设备。在大多数

44、的贫穷的国家运送标本的后勤保证仍然是一个非常严重的问题，很难以一种可靠的方式安排。l 痰盒的种类是非常重要的，并且会影响采集的痰标本的质量。应该是防泄漏的、透明的塑料盒、广口、螺旋盖（螺旋扣为1.5圈），能够防泄漏、防干燥、防止气溶胶的产生(Figure II.1)。容量应该至少20毫升。lll 实验室人员获得进行痰检的病人的基本信息是非常重要的。这可以通过一张痰检申请单而完成(附件 1)，门诊医生和实验室人员都应该有。门诊医生应在申请单上写明申请目的是为了诊断还是治疗随访。实验室人员应记录在登记本上，既用于管理（计算实验室物资需求）也用于流行病学评估。对于随访来说，病人的登记号和治疗的月份应

45、该显示，这种信息也要提供给实验室人员并登记到实验室登记本上。C.痰膜制备和染色挑取痰标本质量最好的部分直接涂片，干燥、固定，用萋尼氏方法染色，在普通光学显微镜下镜检。痰标本也可以经过浓缩后再涂片，用强碱或者次氯酸钠消化后离心沉淀、漂浮甚至是过滤。最初的染色技术应用“饱和复红(Ehrlich)”或者含有0.75%碱性复红的石炭酸复红溶液(Neelsen)。之后不久，Johne与Neelsen交流后建立了一个新的方法：用1%复红，热染至蒸汽产生，25%硫酸脱色，甲基兰复染。然而，随着时间的改变，这项技术已经改进，现在常用的浓度时0.3%石炭酸复红。除了碱性复红外用于光学显微镜检的其他染色技术也被应

46、用，但是从来没有被广泛采用，另一方面各种各样的复红技术的变更倒是很广泛。用饱和（3%）复红染液冷染被称为Kinyoun 染色，尽管最初这种方法包含次氯酸盐消化、漂浮步骤。Gabbett将脱色和复染结合起来，减少操作步骤至两步，这在劳动力昂贵的国家很受欢迎。Tan Thiam Hok染色技术将冷染、饱和初染液与Gabbett修订的方法结合起来，同样被广泛应用。在一项研究中，对多种不同石炭酸复红浓度的染色方法进行了比较， 1%复红热染15分钟表现出最高的敏感度且结果一致性最好。用酒精酸溶液代替硫酸或者其他酸脱色在能够负担的国家采用，因为脱色更加容易干净。代替甲基蓝的孔雀绿有时作为常规应用。用后者的

47、缺点是对于某些色盲或者色弱的试验人员不便（约10%的男性是红绿色盲）。尽管有研究表明苦味酸是最佳的复染液，但是常规应用比较困难。在某些国家光学显微镜被荧光显微镜代替，如在患病率低且人力费用远远高于仪器费用的国家，又如阳性级别低的标本很多的国家。这项技术需要不同的染液。金胺O经常作为初染液，单独或者与罗丹名一起应用以增加分辨率。荧光染色方法的背景染色存在多种方法，高锰酸钾用来猝灭非特异性的荧光，但是也有不复染或者应用哑啶橙、噻嗪红或者甲基兰作为复染的。然而这些方法会大大降低视野与背景的对比度。最近，有人发现用稀释的蓝墨水很好，不仅没有使背景变深还有很好的对比，如果背景过深将会影响聚焦（正如高锰酸

48、钾有时所表现）。加入一些酚将会减少人为假象(data courtesy, K Feldmann, Kuratorium Tuberkulose in der Welt, Gauting, Germany, 2 July 2004)。1 直接制备痰膜制备痰膜之前试验人员必须决定选取哪一部分标本。痰标本往往不是匀质的，除非痰标本放置过夜（如第一份即时痰），这会发生自我分解。如果痰标本有明显的脓性部分，应该选取。细的一次性的涂抹棍（竹质或者类似的材料）比接种环好，因为它容易挑取需要的标本且足够坚固方便涂抹痰膜。而且，竹签用完后可以销毁，接种环在下次接种前必须将其放到含有玻璃珠的酒精溶液中进行清洗、消毒（基层实验室中很少能做到），然后灼烧。显然应用竹签安全、省时。竹签的断端是纤维刷，握住竹签将其与玻片垂直，那么很容易均匀的将标本涂抹在玻片上。椰子叶、棕榈叶纤维很少，木棍往往没有纤维刷断端，涂膜痰膜的效果不太令人满意。l 涂抹好的痰膜并非像看起来那样容易，需