克隆技术简介.doc

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流克隆技术简介【精品文档】第 6 页 克 隆 技 术 介 绍 张 勋 学号：160820216摘 要 克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆 (Clone)”的术语。学家把人工动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“”，其

2、本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先繁殖而形成的纯，该细胞系中每个细胞的彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。克隆也可以理解为复制，就是从原型

3、中产生出同样的复制品，它的外表及与原型完全相同，但大多行为 思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪 70 年代初 DNA 体外重组技术的发明而发展起来的， 其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确

4、定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径： 正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础， 通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着 DNA 测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。 目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用

5、的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。二、部分克隆技术简介1、功能克隆 功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功能着手进行基因克隆， 是人类采用的第一个克隆基因的策略。其基本内容为：根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质， 分离纯化蛋白并测定出部分氨基酸序列，根据遗传密码推测其可能的编码序列，设计相应的核苷酸探针， 杂交筛选 cDNA 文库或基因组文库，或者使用该蛋白质特异的抗体，筛选表达载体构建的 cDNA 文库， 通过抗原抗体反应寻找特异的克隆，最后对选中的克隆测序，获得目的基因的序列。2、定位克隆 定位克隆技术

6、 （positional cloning） 又叫图位克隆（map-based cloning）， 是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法， 适合于克隆编码产物未知的基因。 其基本原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座， 在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上， 用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组文库（如 BAC 和 YAC），用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群， 再通过染色体步行（chromosome walking） 逐步逼近候选区域或通过染色体登陆 （chro-mosome landing）的方法获得含有目标基因的大片

7、段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆，或以大片段克隆作探针筛选 cDNA 文库； 从而将目标基因确定在一个较小的 DNA 片段上并进行序列分析，通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定获得目的基因。定位克隆理论上适用于一切基因， 但由于定位克隆依赖于高密度的分子标记连锁图谱， 因此该技术对于基因组较小， 重复序列少而且已经构建了高密度RFLP 或 RAPD 等标记图谱的植物无疑是非常有效的，3、转座子标签法（transposon tagging）转座子（Transposon）是可从染色体的一个位置转移到另一位置的 DNA 片段， 最早在玉米中发现的，随后的研究表明，在生物界中转座子是普遍存

8、在的，并在生物的遗传进化方面有重要作用。 转座子标签技术克隆基因的基本原理是， 利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相关表型突变的特点，以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因。如果某基因的突变是由于转座子插入而造成的， 那么以转座子序列为探针就可从变异株的基因组中筛选出带有此转座子的部分基因， 再以突变基因的部分序列作探针，即可从野生型文库中克隆出完整的基因。在植物中利用转座子的有玉米的 Ac/Ds，En/Spm 和金鱼草的 Tn3 等，其中应用最多的是 Ac/Ds 双因子系统。4、抑制性差减杂交抑制消减杂交技术（SSH）是 1996 年由 Diatchenko L

9、建立的以抑制性 PCR 为基础的 DNA 消减杂交方法。其依据的技术主要有两点：1、消减杂交；2、抑制 PCR。经抑制消减杂交后的 cDNA 群体不仅富集了差异表达基因（目的基因），而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除， 使消减后的 cDNA 群体为丰度一致的目的基因群体。与其他差异表达基因克隆技术相比，SSH 技术具有明显的优越性： 假阳性率大大降低，这是它的最大优点。 这是由它的两步消减杂交和两次抑制 PCR 所保证的。 高敏感性。在 DDRT 和 cDNA-RDA 中，低丰度的 mRNA 一般不易被检出，SSH 方法所做的均等化和目标片段的富集， 保证了低丰度 mRNA 也可

10、能被检出。 速度快，效率高。 一次 SSH 反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因。 另外， 此技术还具有背景低、重复性好的特点。5、同源序列法同源序列法是根据与待克隆基因同源的已知序列进行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已知，当要克隆类似基因时可先从 Genbank 库中找到有关基因序列，设计出特异引物；以植物基因组 DNA 或者 cDNA为模板， 采取 PCR 或 RT-PCR 的方法来扩增目的基因；扩增的片段经纯化后，连接到合适的载体上，进行序列分析、 比较验证并确认目的基因的克隆。6、基因芯片技术（gene chips） 基因芯片又称 DNA 芯片、DNA 微阵列 （DNA mi

11、-croarray）， 是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交， 再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描， 并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。基因芯片根据功能可分为基因表达芯片（gene expres-sion microarray） 和 DNA 测序芯片 （DNA sequencingchip）

12、2 类；按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片等；根据所用探针的类型可分为 cDNA 微阵列芯片和寡核苷酸阵列芯片。7、电子克隆（electronic cloning）电子克隆， 又称计算机杂交 （computer hybridiza-tion）， 是以数学算法为手段， 以计算机和互联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标签（EST）、蛋白序列和生物信息数据库，发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。 电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守，同源性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸 EST 序列，以获

13、得基因潜在的部分乃至全长的 cDNA 序列。三、克隆技术的应用价值及影响 由于克隆技术可以“复制”出完全相同基因的大量个体群，因此克隆技术被广泛运用于植物、动物、微生物的生产时间好科学研究中，为生物遗传疾病的治疗、优良品种的培育和扩群等提供了重要途径。克隆技术的应用主要表现在以下几个方面：1、 对濒危生物的种质进行保存，抢救濒危灭绝生物；2、 促进物种的优化，快速、有效地繁育优良生物；3、对转基因生物进行扩群，培育转基因生物；4、为医学、科研提供有利技术支持，主要进行治疗性克隆，解决医学难题；5.有计划地协调失衡的生态系统，促进人类可持续发展。 从上述五个方面来看，克隆技术发展至今，无论在农业

14、生产方面还是在生物品种的改良和优化方面都表现出积极的作用，它作为推动生产发展的技术力量，在促进科技进步和社会发展方面有着极其重要的意义。 克隆技术在广泛运用和迅速发展的过程中，其最为核心的影响表现在对人类的可持续发展的影响。 人类长期以来对生态环境的破坏以及对自然资源的掠夺造成了大量的生态问题，使得生态系统恶化。其中最为明显的生态问题就是大量物种的灭绝，每天都有不同的生物从人类历史的长河中消失，而在克隆技术产生以前这种物种灭失是不可逆的，人类无法“制造”已经灭绝的物种。但是，当克隆技术产生后，利用濒危生物的种质对其进行大量的“复制”成为可能，这样就大大改变了生物灭绝的威胁，从而也使自然生态系统

15、得以恢复，还人类一个多样化的世界。其次，利用克隆技术可以对转基因生物进行扩群，培育转基因生物。利用克隆技术进行转基因生物的培育是现代生物技术的一大要点，对人类产生了不可估量的影响，其中最重要的贡献是聚积在农业和医学运用上面。在农业生产中，利用克隆技术可以大量复制基因纯正的动物，并可非常容易地改造动物的基因，这样可以培养大量品种优良的家畜，同时转基因品种的出现大大提高了动植物抗菌、抗病毒、抗虫害等抗性，并且对于提高农作物蛋白质含量、改良氨基酸的组成等方发挥着重要作用。在医学运用中，克隆技术和最新的人胚胎干细胞技术结合而产生的治疗性克隆更成为人类医疗历史上革命性的技术，是生命科学研究具有里程碑意义

16、的重大突破。治疗性克隆是现代医学发展的一个重要方向，它打开了再生医疗的大门，具有无限的潜力。 克隆技术的产生正如其它科学技术一样都是双刃剑, 一方面对生物遗传病的治疗、优良品种的培育和扩群等提供了重要途径, 对物种优化、濒危动物的种质保存 , 对转基因动物的扩群, 为人类有计划地协调已失衡的生态系统具有不可估量的作用, 另一方面, 对克隆技术的错误运用, 对人类社会结构的稳定和完整性具有巨大的影响。在人们在享受克隆技术带来的巨大好处的同时，克隆技术同样对人类的可持续发展提出了问题和挑战。1、克隆技术与人类自身安全的冲突2、克隆技术对生态环境可能产生的不良影响3、克隆技术最为令人不安的因素生殖性克隆对伦理的冲击。因此，面对克隆，我们不得不慎重。