RNA凝胶电泳步骤及注意事项.doc

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1、RNA凝胶电泳步骤及注意事项1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性，本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作原理和操作方法与步骤。 一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 三、实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，

2、电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5g/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。 四、实验步骤 (1)用1TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 (2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4l于封口膜上。在实验台上再加入5l 1TAE电泳缓冲液及1l 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 (3)打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。 试剂： (1)MOPS缓冲液(10*):0.4m

3、ol/L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 (2)上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 (3)甲醛。 (4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)水冲洗乙醇干燥3%H2O2灌满室温放置10分钟0.1%DEPC水冲洗。 操作： (1) 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 (2) 配制琼脂糖凝胶。 称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 待胶凉至60-70 ，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml

4、 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。 灌制琼脂糖凝胶。 (3) 样品准备： 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺(去离子)10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。 将离心管置于60水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 向管中加入3ul 上样染料，混匀。 (4)上样。 (5)电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。 (6)电泳结束后，在紫外灯下检查结果。 小结：RNA琼脂糖凝胶电泳中务必去除RNASE酶的污染，所有的试剂需用DEPC水配制，所用的器材也要的DEPC处理并灭菌，防止RNA被降解