紫杉醇的发酵培养.ppt

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1、紫杉醇的发酵培养 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life, there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 肿瘤肿瘤是一类严重威胁人们生命和生活是一类严重威胁人们生命和生活质量的重大和主要疾病。我国国内每年新质量的重大和主要疾病。我国国内每年新发生癌症患者发生癌症患者160 160 万人万人, , 并有并有130 130 万人死万人死于癌症。发达国家美、欧、日等每年新增于癌症。发达国家美、欧、日等每年新增的癌症患者达的癌症患者达400 400 万人左右万人左右, , 全世界癌症全世界癌症死亡人数每年达死

2、亡人数每年达630 630 万人。长期以来万人。长期以来, , 寻寻找抗癌生物资源与天然药物成为各国医药、找抗癌生物资源与天然药物成为各国医药、化学及生物学家的一个共同愿望化学及生物学家的一个共同愿望。 美国西部山区有一片红豆杉林，山林中有一个美国西部山区有一片红豆杉林，山林中有一个小村镇小村镇，住，住着着2000多居民。这个小村镇虽然不大，却以长寿而闻名美国。多居民。这个小村镇虽然不大，却以长寿而闻名美国。小村镇里，寿命最短的人都活到小村镇里，寿命最短的人都活到95岁以上，绝大多数人的寿命岁以上，绝大多数人的寿命都在都在100岁以上，百岁寿星处处可见！岁以上，百岁寿星处处可见！ 这则新闻吸引

3、了不少这则新闻吸引了不少科学家的目光，纷纷到这科学家的目光，纷纷到这来考察，然而他们并没有来考察，然而他们并没有发现这里人的奇异之处，发现这里人的奇异之处，饮食生活与其他地区人群饮食生活与其他地区人群并无太大差别。仔细观察并无太大差别。仔细观察以后，发现这里的居民有以后，发现这里的居民有两个与红豆杉有关的生活两个与红豆杉有关的生活习惯，一是他们好采摘红习惯，一是他们好采摘红豆杉树叶泡茶喝豆杉树叶泡茶喝; ;二是经二是经常到红豆杉树林中散步或常到红豆杉树林中散步或者运动。者运动。 这种现象引起了科学家的极大兴趣。这种现象引起了科学家的极大兴趣。经过不懈努力，美国施宝贵公司于经过不懈努力，美国施宝

4、贵公司于19921992年年从红豆杉中提取出天然抗癌物质从红豆杉中提取出天然抗癌物质紫杉醇紫杉醇。接着，英国、俄罗斯、韩国和中国的科研接着，英国、俄罗斯、韩国和中国的科研人员也都从中提取出这种珍贵的药物。人员也都从中提取出这种珍贵的药物。 但是，人们发现紫杉醇具有独特的但是，人们发现紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用，能够显著地抑制肿瘤生长，抗肿瘤作用，能够显著地抑制肿瘤生长，对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卡波济肉瘤等疗效确切，而且副作用很卡波济肉瘤等疗效确切，而且副作用很小。当世界各国都为无法攻克癌症而焦小。当世界各国都为无法攻克癌症而焦灼的时候，红豆杉中紫

5、杉醇的发现像一灼的时候，红豆杉中紫杉醇的发现像一棵救命的灵芝草，给癌症患者带来了生棵救命的灵芝草，给癌症患者带来了生的希望。的希望。 副作用副作用紫杉醇的紫杉醇的抗癌机理抗癌机理 紫杉醇能选择性地与微管蛋白结合紫杉醇能选择性地与微管蛋白结合, 促进促进微管蛋白双聚体聚合为多聚体。对迅速分裂微管蛋白双聚体聚合为多聚体。对迅速分裂的肿瘤细胞的肿瘤细胞,紫杉醇冻结有丝分裂纺锤体紫杉醇冻结有丝分裂纺锤体, 从从而使有丝分裂停止在而使有丝分裂停止在G2 期和期和M 期期, 阻止了阻止了癌细胞的快速繁殖直至死亡。作用于巨噬细癌细胞的快速繁殖直至死亡。作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子胞上的肿瘤坏死因子( TN

6、F) 受体受体, 促使释促使释放白细胞介质放白细胞介质IL21 、TNF22 、IL26 、干、干扰素扰素( IFN) 21 、IFN22 , 对肿瘤细胞杀对肿瘤细胞杀伤或抑制作用伤或抑制作用; 诱导肿瘤细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡 。 除此以外，随着科学技术的不断发除此以外，随着科学技术的不断发展，紫杉醇的展，紫杉醇的新用途新用途也被不断发现。据也被不断发现。据欧洲医生欧洲医生杂志报道，紫杉醇对多种慢杂志报道，紫杉醇对多种慢性顽症有较好的治疗作用，比如进行性硬性顽症有较好的治疗作用，比如进行性硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、湿疹等，化症、风湿性关节炎、牛皮癣、湿疹等，治疗效果都不错。随着时间的推移

7、，紫杉治疗效果都不错。随着时间的推移，紫杉醇的用途进一步被人们所认识，其治疗适醇的用途进一步被人们所认识，其治疗适用范围还会扩大。用范围还会扩大。 紫杉醇具有如此神奇的作用，本应该进行大面紫杉醇具有如此神奇的作用，本应该进行大面积、大量开发红豆杉。然而，不容乐观的是，积、大量开发红豆杉。然而，不容乐观的是，全世界每年紫杉醇的产量都在全世界每年紫杉醇的产量都在300300千克以下，千克以下，因为红豆杉是濒临灭绝的珍稀植物，是第三纪因为红豆杉是濒临灭绝的珍稀植物，是第三纪冰川期遗留下来的。冰川期遗留下来的。 加之紫杉醇在树皮中的含量极低加之紫杉醇在树皮中的含量极低, ,仅为仅为干重干重的的0.10

8、1 %0.101 %0.106 % ,0.106 % ,且生长缓慢且生长缓慢, ,植株成熟约植株成熟约需需100 100 年。约年。约3 36 6棵棵100 100 年左右的红豆杉树皮年左右的红豆杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫杉醇。因此杉醇。因此, ,紫杉醇来源仍将成为该药长期供紫杉醇来源仍将成为该药长期供应的关键制约因素应的关键制约因素. .人们想到了一些方法 人们从人们从T.Media“Hicksii”和和T.Media“ Hill ”这两种植物的根中这两种植物的根中提取到紫杉醇，含量红豆杉属植物的提取到紫杉醇，含量红豆杉属植物的4

9、倍，但是大田种植倍，但是大田种植,3 年才能收割年才能收割一次，不太理想。一次，不太理想。打破休眠打破休眠 扦插扦插 植物中提取植物中提取快速繁殖方法快速繁殖方法 全合成全合成Wender 的逆合成分析的逆合成分析巨大的社会效益、经济效益和极为重要的学术价巨大的社会效益、经济效益和极为重要的学术价值吸引了全球范围内的值吸引了全球范围内的40 多个一流的研究小组多个一流的研究小组从事紫杉醇的全合成工作从事紫杉醇的全合成工作.Mukaiyama 的逆合成分析的逆合成分析1994 年初年初,Holto和和Nicolaou 几乎同时宣告几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得成功紫杉醇的全合成获得成功. 二者的

10、全合成工作二者的全合成工作完成的十分出色完成的十分出色,但合成路线均太长但合成路线均太长,且中间步且中间步骤的收率又相差很大骤的收率又相差很大,导致紫杉醇的最终收率导致紫杉醇的最终收率均很低均很低. 最高只能达到最高只能达到2. 7 % ，目前来看，目前来看,紫杉醇的化学全合成还仅具有研究意义紫杉醇的化学全合成还仅具有研究意义,缺少缺少商业价值商业价值. 部分合成法（半合成法）部分合成法（半合成法） 10 - 去乙酰巴卡亭去乙酰巴卡亭，可从天然红豆杉针叶中以，可从天然红豆杉针叶中以0. 1 %的含量的含量分离得到分离得到,为化学半合成提供了较丰富的原料。为化学半合成提供了较丰富的原料。紫杉醇的

11、半合成方法紫杉醇的半合成方法已比较成熟已比较成熟,国外已用半合成法生产紫杉醇。国外已用半合成法生产紫杉醇。 离体细胞培养法离体细胞培养法细胞系细胞系 诱导子诱导子 农杆菌农杆菌Ti 和和 Ri 质粒介导质粒介导 愈伤组织褐化愈伤组织褐化 发酵培养法发酵培养法 首先，看看微生物发酵工程与医药及我首先，看看微生物发酵工程与医药及我们生活的关系们生活的关系1 1、 抗生素抗生素 自自19291929年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌

12、素素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素. .在在近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发酵法大量生产和广泛应用的多达百余种酵法大量生产和广泛应用的多达百余种. . 2 2、维生素类药物、维生素类药物 维生素作为六大生命要素之一，为整个生命活动所必维生素作为六大生命要素之一，为整个生命活动所必需需.VA.VA的前体的前体-胡萝卜素及胡萝卜素及VCVC和和VEVE均为抗氧化剂，能均为抗氧化剂，能保护人体组织的过氧化损伤并提高机体免疫力，有抗保护人体组

13、织的过氧化损伤并提高机体免疫力，有抗癌、抗心血管疾病和白内障等功能癌、抗心血管疾病和白内障等功能. . 就拿就拿VcVc为例，为例，VcVc的微生物发酵法早已取得重要突破，的微生物发酵法早已取得重要突破，利用利用“大小菌落大小菌落”菌株混合培养生产菌株混合培养生产VCVC的工艺已经成的工艺已经成熟，进入产业化熟，进入产业化. .目前利用氧化葡萄糖杆菌与一种蜡目前利用氧化葡萄糖杆菌与一种蜡状芽孢杆菌混合菌共固定化发酵技术，可将状芽孢杆菌混合菌共固定化发酵技术，可将VcVc的收率的收率提高到提高到80%80%以上，生产周期比传统工艺缩短以上，生产周期比传统工艺缩短1/3.1/3.3 3、医用酶制剂

14、、医用酶制剂 目前，我国每年约有目前，我国每年约有6060万人死于冠心病，约万人死于冠心病，约120120万人死于脑梗塞、脑溢血，而美国每年约万人死于脑梗塞、脑溢血，而美国每年约有有1515万人死于中风，约万人死于中风，约80%80%的病例是由于阻止的病例是由于阻止血液流向大脑的血凝块引起而导致突发性死亡，血液流向大脑的血凝块引起而导致突发性死亡，而通过微生物可以大量生产出高浓度和活力的而通过微生物可以大量生产出高浓度和活力的溶栓酶，并且成本很低。溶栓酶，并且成本很低。4 4、多烯脂肪酸、多烯脂肪酸多烯脂肪酸，如多烯脂肪酸，如-亚麻酸亚麻酸(GLA)(GLA)和二十二碳六烯和二十二碳六烯酸（酸

15、（DHADHA），是人体不能合成而又必需的多烯脂肪酸），是人体不能合成而又必需的多烯脂肪酸缺乏时会导致机体代谢的紊乱而引起多种疾病，如高缺乏时会导致机体代谢的紊乱而引起多种疾病，如高血压、糖尿病、癌症、病毒感染以及皮肤老化等血压、糖尿病、癌症、病毒感染以及皮肤老化等. . 海洋中有一种繁殖力很强的网粘菌海洋中有一种繁殖力很强的网粘菌SR21SR21，其干菌，其干菌体体DHADHA含量为含量为30%30%40%40%，可通过发酵生产，可通过发酵生产DHADHA，每升培，每升培养液产量为养液产量为4.5g4.5g。 一、原理：一、原理：人们发现红豆杉内生真菌也能产紫杉人们发现红豆杉内生真菌也能产紫

16、杉醇，这无疑为解决紫杉醇药源危机提醇，这无疑为解决紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。供了一种新的途径。二、方法二、方法 将树皮洗净将树皮洗净,用用75 %酒精浸泡酒精浸泡510 min 进进行表面消毒行表面消毒,再用无菌水冲洗再用无菌水冲洗,然后剪切成长然后剪切成长宽为宽为1 cm 1 cm 的小块的小块, 接种于琼脂培养接种于琼脂培养基上基上, 于于(24 1) 培养。待树皮表面长出培养。待树皮表面长出菌丝后菌丝后,挑取其菌丝尖端挑取其菌丝尖端,进行稀释进行稀释,接种到接种到PDA 培养基上培养基上,使每个培养皿长出使每个培养皿长出13 个菌个菌落落,连续继代纯化连续继代纯化8 次以上次以上

17、,得到纯化菌株。得到纯化菌株。1) 内生真菌的分内生真菌的分离离多样性多样性图图1 分离到的内生真菌菌落分离到的内生真菌菌落IBPCZ3S 菌株菌株IBPCZ3S 在在PDA 培养基上菌落轮纹明显培养基上菌落轮纹明显,内层内层黑褐色黑褐色,边缘白色边缘白色,铺展、致密、圆形铺展、致密、圆形,边缘整齐边缘整齐,7 d 后后出现辐射状沟纹。出现辐射状沟纹。图图2 IBPCZ3S 菌株菌丝形态特征菌株菌丝形态特征菌丝无色菌丝无色,分枝分枝,具有横隔膜。菌丝生长较快具有横隔膜。菌丝生长较快,5 d后直径达后直径达62m。孢子丰富。孢子丰富,分生孢子穗炭黑色分生孢子穗炭黑色,圆形呈放射状。分生圆形呈放射

18、状。分生孢子梗无色或呈现黄褐色孢子梗无色或呈现黄褐色,光滑光滑,分生孢子小分生孢子小,球形球形,壁上有刺壁上有刺纹。纹。2) 内生真菌的培养内生真菌的培养: 液体培养基，将纯液体培养基，将纯化菌株接种到液体培养基中培养化菌株接种到液体培养基中培养种子菌种子菌,3 d 后后,取取5 mL 液体种液体种子菌转入发酵罐中发酵。子菌转入发酵罐中发酵。：2.8L 和和10L 小罐发酵方法：小罐发酵方法：以以3%接种量将种子培养液接入已接种量将种子培养液接入已灭菌灭菌(2.8L 小罐进行实罐灭菌小罐进行实罐灭菌,10L 罐先空消罐先空消,再用无菌压缩空气吹干后加入灭过菌的培再用无菌压缩空气吹干后加入灭过菌

19、的培养基养基)、冷却的发酵培养基中，、冷却的发酵培养基中，200 r/ min ，28通风培养通风培养1618d，定期测定，定期测定发酵液中紫杉醇含量、生物量、总糖和发酵液中紫杉醇含量、生物量、总糖和pH 值。值。3) 紫杉醇提取方法紫杉醇提取方法 发酵液过滤，滤渣烘干（低于发酵液过滤，滤渣烘干（低于50），），滤液称量体积。滤渣用适量乙酸乙酯萃取，滤滤液称量体积。滤渣用适量乙酸乙酯萃取，滤液用液用1/2 滤液体积的乙酸乙酯萃取，下层水滤液体积的乙酸乙酯萃取，下层水层再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，减层再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，减压蒸干。用适量甲醇洗涤减压蒸干的固体，加压蒸干。用

20、适量甲醇洗涤减压蒸干的固体，加入乙酸乙酯和水入乙酸乙酯和水1 1 (V/V)再进行萃取，将再进行萃取，将收集的乙酸乙酯进行减压蒸干，用一定量的乙收集的乙酸乙酯进行减压蒸干，用一定量的乙腈溶解固体，腈溶解固体，0密封保存。密封保存。超临界超临界CO2提取法提取法（SFT法）法）超临界流体萃取技术是近代化工分离中的一种新型分离技术，超临界超临界流体萃取技术是近代化工分离中的一种新型分离技术，超临界CO2萃取是采用萃取是采用CO2作溶剂，超临界状态下的作溶剂，超临界状态下的CO2流体密度和介电常数流体密度和介电常数较大，对物质溶解度很大，并随压力和温度的变化而急剧变化，因此，较大，对物质溶解度很大，

21、并随压力和温度的变化而急剧变化，因此，不仅对某些物质的溶解度有选择性，且溶剂和萃取物非常容易分离。超不仅对某些物质的溶解度有选择性，且溶剂和萃取物非常容易分离。超临界临界CO2萃取特别适用于脂溶性，高沸点，热敏性物质的提取，同时也萃取特别适用于脂溶性，高沸点，热敏性物质的提取，同时也适用于不同组分的精细分离，即超临界精镏。用超临界适用于不同组分的精细分离，即超临界精镏。用超临界CO2作溶剂对生作溶剂对生物、食品、药物等许多产物的提取和纯化。物、食品、药物等许多产物的提取和纯化。 4) 紫杉醇的鉴定紫杉醇的鉴定 薄膜层析薄膜层析，取标准品紫杉醇溶液，取标准品紫杉醇溶液2L ,样品溶液样品溶液10

22、L ,分别点样于硅胶板上分别点样于硅胶板上,置置于层析缸中展开于层析缸中展开,晾干晾干,喷雾显色。观察喷雾显色。观察斑点的大小、位置和颜色斑点的大小、位置和颜色,目测估计紫杉目测估计紫杉醇及紫杉烷类化合物的含量。同样，还醇及紫杉烷类化合物的含量。同样，还可以用可以用紫外吸收法紫外吸收法或或HPLC测定紫杉醇的测定紫杉醇的含量含量菌株的最高产率约为菌株的最高产率约为1 mg/ L 5) 优化优化 研究培养基组成和培养条件对紫杉醇产研究培养基组成和培养条件对紫杉醇产量的影响量的影响 。l碳源的影响碳源的影响选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖为碳源选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖为碳源, 观察其对菌体观察

23、其对菌体生长和紫杉醇产量的影响。结果表明生长和紫杉醇产量的影响。结果表明: 蔗糖和麦芽糖为碳源时紫杉醇含量相对较高蔗糖和麦芽糖为碳源时紫杉醇含量相对较高, 在以葡萄糖在以葡萄糖和乳糖为碳源时含量较低。和乳糖为碳源时含量较低。l氮源的影响氮源的影响 分别考查氯化铵、硝酸铵、硫酸铵和蛋白胨等分别考查氯化铵、硝酸铵、硫酸铵和蛋白胨等氮源对菌株产紫杉醇产量影响。结果表明氮源对菌株产紫杉醇产量影响。结果表明:不不同氮源对紫杉醇的产量同氮源对紫杉醇的产量影响较大影响较大。以氯化铵和。以氯化铵和硫酸铵为氮源时硫酸铵为氮源时,菌丝生长较好菌丝生长较好, 紫杉醇产量紫杉醇产量明显比以硝酸铵为氮源时高明显比以硝酸

24、铵为氮源时高, 而以蛋白胨为氮而以蛋白胨为氮源时源时, 紫杉醇产量急剧下降紫杉醇产量急剧下降, 可能是蛋白胨的可能是蛋白胨的某些成分抑制了紫杉醇的产生。某些成分抑制了紫杉醇的产生。l补加蔗糖的影响补加蔗糖的影响总糖随时间的变化关系总糖随时间的变化关系补加蔗糖量对菌体干重和紫杉醇产量的影响补加蔗糖量对菌体干重和紫杉醇产量的影响发酵过程中发酵过程中24 h时补加蔗糖量对菌体生长和紫杉醇产量的影响。结果表明时补加蔗糖量对菌体生长和紫杉醇产量的影响。结果表明: 在一定范围内在一定范围内, 随补加蔗糖量的增加随补加蔗糖量的增加, 可以促进菌体的新一轮生长和繁殖可以促进菌体的新一轮生长和繁殖, 且紫杉醇含

25、量也增加且紫杉醇含量也增加, 而当每升补加蔗糖量为而当每升补加蔗糖量为30 g 时时, 菌体干重和紫杉醇产菌体干重和紫杉醇产量都开始下降。这可能因为糖浓度提高而对应的提高了渗透压量都开始下降。这可能因为糖浓度提高而对应的提高了渗透压, 导致膜蛋白导致膜蛋白部分降解部分降解, 使菌体通透性增加使菌体通透性增加, 而使代谢物更多地向胞外释放而使代谢物更多地向胞外释放 , 促进了产物促进了产物的合成速率的合成速率, 提高了产量提高了产量, 但过高的糖浓度导致发酵液粘度增加但过高的糖浓度导致发酵液粘度增加, 菌体呼吸菌体呼吸困难困难, 进而抑制了紫杉醇的生产。进而抑制了紫杉醇的生产。l前体饲喂的影响前

26、体饲喂的影响在内生真菌的发酵过程中在内生真菌的发酵过程中, 前体对紫杉醇有一定影响。结果表明前体对紫杉醇有一定影响。结果表明, 与对照组相比较与对照组相比较, 苯丙氨酸的浓度对紫杉醇的产量影响显著苯丙氨酸的浓度对紫杉醇的产量影响显著,其其原因可认为苯丙氨酸为紫杉醇合成的底物。原因可认为苯丙氨酸为紫杉醇合成的底物。 三、总结三、总结 真菌发酵法制备紫杉醇是一个很有前景的技真菌发酵法制备紫杉醇是一个很有前景的技术，它有自己的优点术，它有自己的优点： u可以很轻易地改变培养基组成和发酵可以很轻易地改变培养基组成和发酵条件，如碳源、氮源、糖含量和前体，条件，如碳源、氮源、糖含量和前体，从而获得最佳产量从而获得最佳产量u与天然红豆杉相比，它具有周期短，与天然红豆杉相比，它具有周期短，产量高等优势产量高等优势u此外真菌的基因操作比植物容易得此外真菌的基因操作比植物容易得多多,因而因而,有可能通过基因工程的方有可能通过基因工程的方法来增加紫杉醇在真菌中的产量法来增加紫杉醇在真菌中的产量. 发酵培养有着巨大潜在价值发酵培养有着巨大潜在价值 由于发酵工程具有显著的由于发酵工程具有显著的经济效益经济效益、社会效益社会效益和和生态效益生态效益, 它将对各领域生它将对各领域生产发展作出越来越大的贡献。产发展作出越来越大的贡献。