2022年适用于竹林土壤PCR_DGGE分析用的微生物总DNA提取及纯化方法 .pdf

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1、适用于竹林土壤PCR-DGGE 分析用的微生物总DNA 提取及纯化方法摘要：为了获得完整、高纯度的竹林土壤微生物总DNA ，采用改良的十二烷基硫酸钠-高对5 种竹林土壤进行DNA 提取，通过DNA 凝胶回收试剂盒纯化粗提的DNA ，利用细菌16 SrDNA 基因的 V3 区引物对纯化的DNA 进行了聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE ）验证。结果表明，该方法所需土壤样品少，抽提的DNA 片段均在 23kb 以上，完整性好；采用DNA 凝胶回收试剂盒纯化能够有效去除粗提DNA 中大部分杂质，获得高质量的DNA ；以此 DNA 为模板进行DGGE 检测所反映的微生物信息量丰富。变性

2、梯度凝胶电泳（ denaturing gradient gel electrophoresis ， DGGE）技术从1993 年被引入微生物生态学以来，已经普遍应用于微生物研究，成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具之一 1 。 获得样品中所有种类微生物的DNA 是应用DGGE 技术的前提和关键。然而，来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐植酸类物质很难去除。另外， 实际样品中微生物细胞壁的坚实度不同，如不注意就会选择性地获得那些易破细胞壁的微生物DNA ， 而且有些样品DNA 回收率低，造成重复性降低2 。 因此，需要摸索适合具体样品的DNA 提取方法。近 30 a 来

3、，国内外在这方面作了大量研究，如Porteous 等3使用加热 -酶-异硫氰酸胍裂解细胞提取总DNA ； Zhou 等 4使用蛋白酶 K 和十二烷基硫酸钠（SDS）破解 细 胞提取总DNA 。 这些方法提取的土壤微生物 DNA 产量高，但杂质也多，其中以腐植酸污染最为严重，直接影响后续聚合酶链式反应 -变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE ）实验的准确性。鉴于此，人们又尝试许多方法去除腐植酸的影响，如 He 等5使用磷酸盐缓冲液预洗土壤后再提取DNA ， Dong 等6尝试采用Al2 （SO4）3 去除土壤DNA 中的腐植酸，获得良好效果。目前，针对竹林土壤微生物总DNA 提取以及利用PCR-D

4、GGE 分析竹林土壤微生物群落多样性的研究还未见报道。笔者拟在以往研究的基础上，通过摸索和改进4，7-8 ， 建立一种适应于竹林土壤 PCR-DGGE 分析用的DNA 提取和纯化方法，为进一步研究竹林土壤微生物群落结构和多样性打下良好的基础。1 材料和方法1.1 材料实验土样于2007 年 8 月取自浙江林学院吉永竹园。分别采集了雷竹Phyllostachys praecox， 紫竹 Phyllostachys nigra ， 刚 竹 Phyllostachys sulphurea， 龟 甲 竹 Phyllostachys heterocycla 和 黄 秆 乌 哺 鸡 Phyllostach

5、ys vivax 等 5 种竹林的土壤，采样深度为0 10 cm， 按五点法采样，四分法混匀放入保鲜袋中，封口后，带回实验室，4 保存。1.2 竹林土壤微生物总DNA 提取方法1.2.1 粗提首先按照Zhou 等 4报道的SDS 高盐抽提法（简称常规法）提取了5 种竹林土壤微生物的总DNA ， 作为对照。采用的改良SDS 高盐抽提法（简称改良法）参照常规法修订而成，即在高盐提取液中添加石英砂，以反复冻融代替水浴破碎细胞，并且在氯仿 -异戊醇抽提过程增加了NaCl/CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）溶液2 次抽提的步骤。具体操作如下：称取 1.0 g 土壤样品，与 4.5 mL DNA提取缓冲液

6、 （Tris-HCl 100 mmol L1， EDTA 100 mmol L1，Na3PO4100 mmol L1， NaCl 1.5 molL1， 10.0g kg1CTAB ， pH 8.0） 混合，加少许石英砂，于 230 r min1 摇床上37 摇动30 min； 随后加入0.5mL 200 g kg1 SDS， 混合物于65 水浴20 min （每隔1015 min 轻轻上下颠倒几次） ， 80 冷冻15min， 反复冻融2 次。 室温6 000 rmin-1 离心 10 min ， 收集上清，加入 1/10 体积65 预热的NaCl/CTAB 溶液 （100 g kg1CTAB

7、 ， 0.7 molL1NaCl）和等体积的氯仿-戊醇， 轻摇混匀，室温下10 000r min-1 离心 6 min， 吸取上层水相。重复抽提12 次，吸取水相转移至新离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇，室温沉淀15 min， 10 000 r min 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - -1 离心10 min 收集核酸沉淀。用体积分数为70%乙醇洗涤2 次， 室温风干，用 200 L TE 缓冲液（ 10 m

8、mol L1Tris-HCl ， 1 mmol L1EDTA ， pH 8.0）溶解沉淀，4保存。1.2.2 DNA 的纯化采用DNA 凝胶回收试剂盒纯化粗提DNA 。 具体操作与试剂盒说明略有差异：将粗提的DNA 与溶液以3 1 混合，室温放置10 min， 然后将混合液加入到回收柱中，静置2 min，离心。 用 0.5 mL 体积分数为75%乙醇清洗2 次， 最后用100 L TE 缓冲液洗脱回收柱中的DNA 。1.3 土壤 DNA 的质量检测1.3.1 紫外分光光度计检测采用美国Nanodrop 公司的ND-1000 紫外分光光度计测定粗提 DNA 在 230， 260， 280 nm

9、处的光密度值。以 1 L DNA 直接上样进行测定，其中 DNA 浓度可以直接读数，并以A260/ A230 （DNA/ 腐植酸）和A260/ A280 （DNA/ 蛋白质）的比值来评价DNA 的纯度。1.3.2 PCR-DGGE 检测 为了进一步检测改良法提取的DNA 是否能反映微生物群落信息，以上述经过纯化的土壤微生物DNA 为模板，采用 16 S rDNA V3 区通用引物进行扩增，并进行DGGE 分析。扩增正向引物为16 S rDNA V3 区通用带GC 发夹引物F341-GC ，序列为：5 （CGCCCGCCG CGC GCGGCG GGC GGG GCG GGG GCACGGGGG

10、 G）CCT ACG GGA GGC AGC AG3 ； 反向引物R518 序列为： 5ATTACC GCG GCT GCT GG 3 。PCR 反应体系：10 缓冲液5 L ， 3.2 mmol L1Mg2+ ， 0.8 mmol L1dNTPs， PCR 引物各0.5 molL1， 41.7 nkat Taq 酶， 模板（纯化的土壤微生物DNA ）120 ng ， 总反应体积50 L 。 反应参数：94 预变性5 min； 92 变性30 s， 55 退火30 s； 72 延伸30 s， 30 个循环；72 完全延伸5 min。 DGGE 分析采用美国BIO-RAD 公司DCODETM 的

11、基因突变检测系统进行。用于分离的聚丙烯酰胺凝胶质量分数为80 g kg1 ， 变性剂梯度为35% 55% （100 %变性剂浓度为7mol L1 的尿素和400 g kg 1的去离子甲酰胺的混合物） ， 在每个加样孔加入上述PCR 样品 200 300ng。 电泳条件：1 TAE 电泳缓冲液，60 ， 65 V， 13 h。 电泳结束后，按快速银染法染色9 ： 凝胶在固定液（ 75.0 g kg 1 的冰乙酸）固定15 min ， 加 入 2 g kg1 的硝酸银染色15 min，然后在显色液（30.0 g kg 1 氢氧化钠，5.0 g kg1 甲醛）中显色5 min ， 最后加固定液终止反

12、应。 每一步均用去离子水冲洗胶面2 3 遍， 在 Bio-Rad 公司凝胶成像系统Gel Doc2000 中成像。2 结果与分析2.1 不同竹林土壤中微生物基因组DNA 提取分别用常规法和改良法提取了5 种竹林土壤微生物总DNA 。 从琼脂糖电泳图上可以看出（图1） ，改良法从5 种竹林土壤中都提取出了DNA ， 且 DNA 带型清晰完整，其片段大于23 kb， 无明显降解。常规法提取的1 号和 2 号样品DNA 没有明显电泳条带，3 号、4 号和5 号样品DNA 也只有较弱的电泳条带，说明DNA 提取量低。因为提取DNA 所用的土壤都是4 保存的鲜土，所以所得DNA 产量为所测DNA 质量

13、/鲜土质量。腐植酸和蛋白质分别在230 nm 和 280 nm 处有吸收峰 10 ， 可以通过测定A260 / A230（ DNA/ 腐植酸）和A260/ A280 （DNA/ 蛋白质）的比值来评价DNA 的纯度：A 260/ A230 比值越大， 腐植酸污染越少，DNA 越纯； 一般认为，A260/ A280 比值大于1.8 时， DNA 较纯， 否则有蛋白质污染 11 。 本实验中， 改良法提取的DNA 产率在10.53 23.71 gg1， 3 号土样DNA 提取率最高， 达 23.71 gg1， 4 号土样的提取率相对较低，但是都获得了较高的提取率，而常规法提取的DNA 产率非常低，得

14、率最高的仅 4.44 gg 1。 A260/ A280 和 A260/ A230 的比值显示，2 种方法提取的DNA 均存在一定程度的腐植酸和蛋白质等杂质污染，但改良法的比值明显优于常规法，特别是A 260/ A230 的比值远远高于常规法（表1） 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - 表 1 用 2 种方法粗提的5 种竹林土壤样品中DNA 产量和纯度比较2.2 土壤基因组DNA 的纯化和 PCR-DGGE 检测在上

15、述DNA 提取过程中虽然除去了部分污染物，但所提DNA 中仍然有不同程度的腐植酸等杂质，而低量的腐植酸也会干扰下一步的操作，如 PCR 扩增、 杂交等。在实验中，我们试图以粗提的DNA 为模板直接进行PCR 扩增，但部分土样扩增效果欠佳（电泳图未给出）。 为了获得理想的扩增效果，保证后续实验的可靠性和扩大该方法的适用性，本实验采用DNA 凝胶回收试剂盒直接纯化粗提的土壤微生物总DNA 。 图 2 中显示，所有以改良法总DNA 纯化产物为模板的PCR 反应都获得特异性扩增片段，常规法3 号、4 号和5 号样品DNA 有较弱的扩增条带。将各个样品扩增产物作为变性梯度凝胶电泳（DGGE ）的样品，所

16、得微生物信息图谱如图3 所示。在相同的电泳条件下，改良法所提的土壤样品微生物总DNA 经过DGGE 都可以分离出数目不等的电泳条带，各样品之间表现出了不同竹种竹林微生物群体差异。常规法的5 号样品分离出少量微弱的条带，其他样品则没有检测到条带。PCR 和 DGGE 的电泳图上第11 泳道为以无菌水为模板的阴性对照，没有检测到微生物信息，表明实验过程无微生物污染干扰。3 讨论从土壤中充分裂解微生物，获得总微生物DNA 是研究土壤微生物的关键。微生物细胞与土壤粘附较牢，不易分开，导致靶微生物丢失较多。Zhou 等 4认为，从砂质土壤中释放微生物要比黏性土壤容易。常用机械破碎方法如玻璃珠振荡法12

17、、 超声波法3 、 液氮研磨法 13 ， 或是几种方法的组合来破碎细胞14 ， 但过度剧烈的机械破碎法易导致DNA 片段的断裂，而在分子生态学研究中，大片段的 DNA 是用于进一步的分子生物学操作的保证。改良法中采用振荡的方法结合反复冻融，并且加入石英砂，增加了土壤的砂性，获得了良好的细胞裂解效果，不仅所得DNA 产率高，也有利于提高DNA 的纯度。实验中避免了超声波等处理，所得DNA 的完整性也很好。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 4 页 - - - -

18、 - - - - - 在土壤微生物DNA 抽提中最主要的污染物是腐植酸，其结构千差万别，可以螯合Mg2+ 或是和DNA 或蛋白质发生共价结合，从而抑制酶的活性，影响后续的实验操作。并且，对于不同的土壤，腐植酸组成和特点不同。因此，一种方法处理不同的土壤，会有不同的提取效果。CTAB 可用于细胞裂解，还有助于去除腐植酸4 。在加入酸类或者高浓度的盐类物质时可使腐植酸产生凝絮15 。 改良法针对竹林土壤，在提取液和抽提液中都使用了 CTAB ， NaCl/CTAB 抽提液还提供了高盐环境。在改良法的抽提过程中，可以看到水相和有机相之间有一层絮状物，很有可能是絮凝的腐植酸类物质。根据粗提DNA 紫外

19、扫描的A260/A280 和 A260/A230 的比值可以看出，常规法提取的DNA 中蛋白质和腐植酸污染严重，而改良法粗提的DNA 中污染物较少，很可能是上述抽提过程中去除了大部分的腐植酸等杂质。 粗提的DNA 可采用DNA 凝胶回收试剂盒进行过柱纯化，过柱纯化时不需要电泳割胶等繁琐操作，且纯化后DNA 的 PCR 扩增效果良好，表明过柱纯化可进一步有效去除DNA 中少量的腐植酸等杂质，是一种获得高纯度土壤微生物总DNA 的有效手段。除了浓度和纯度外，在后续DGGE 实验中，要进行微生物多样性和群体结构的分析还要求所得 DNA 包含样品中绝大部分微生物的信息。本文通过改良法提取的土壤样品PCR-DGGE 实验均可分离出数目不等的电泳条带，且各个条带的强度和迁移率各不相同，说明各样品之间能够表现出一定的微生物群体差异，故该方法抽提的土壤微生物基因组DNA 可作为PCR-DGGE 实验的模板，用于对竹林土壤微生物群体的多样性分析。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - -