2022年质粒DNA的转化 .pdf

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1、一实验名称：质粒DNA 的转化二实验目的： 将编码目的蛋白的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量扩增并表达目的蛋白三实验原理：转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌 （受体细胞） 经理化方法处理后， 细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞

2、）四实验步骤 ; 1.把固态培养基加热融化， 由于温度较热用自来水冲洗瓶身降温（十度左右会再凝固， 所以不能冲洗太久） ，在超净台中加入千分子一的AP（本质粒具有抗AP 性，故 AP 能抑制别的细菌生长），然后向平皿中倒入少许（大约5 毫升）培养基，表明自己名字2.到-80冰箱取出质粒（每瓶100 微升，可制作两板）迅速放入冰盘保存，放入 4保存 30min 3.将上述混合物放在42水浴锅中融化90s（据经验 42 度 90s 最适合），在超净台中用针尖沾取少许质粒放入大肠杆菌EP 管内（质粒名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - -

3、- - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - 为提纯多的所以加很少，一般未提纯的加1 微升），再加200 微升无抗培养基，加完后放回冰盘（热：壁通透性大，冷:通透性小，起封闭作用）放入摇床15min 。4. 摇完后用微量加样枪析出滴到制作好的培养皿的中央，然后慢慢铺满平皿底部 （千万不能滑到边缘， 由于量比较少， 滑到边缘就不容易再铺），表明细菌名称，实验时间，放入4温箱隔夜保存5. 观察有稀疏斑点状菌落， 从 4 度冰箱取出培养基， 在超净台中， 取四支带帽试管（表有黄线者为抗AP ）分别倒入培养基至黄线处；用过火的镊子夹取

4、黄枪尖 （枪尖过火要快以防烧焦） 按象限沾取菌落一枚，放入试管中，注意整个过程要过火。6. 将试管放入摇床中，未完待续五实验结果 : 六注意事项： 1. 培养基溶解后冲洗降温不要太久以免再凝固2. 取质粒尽可能的一直放入冰盒3.42 度 90s 4.铺板要匀！【原理】转化是将外源DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制- 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R- ，M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复名师资

5、料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - 制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA 分子的细胞）。本实验采用CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0 4 ， CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA 形成抗DNA 酶的羟基- 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 90 秒热激处理，促进细胞吸收DNA 得合物。将细菌放

6、置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药 （Amp r ）得到表达， 然后将此细菌培养物涂在含Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人Bcl-2 重组质粒转化DH5 扩增菌，转化后在含Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2 重组质粒的DH5 菌用于质粒DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA 。【试剂与器材】1 LB 液体培养基10g 胰蛋白胨 、 5g 酵母提取物、10gNaCl 加水至1L ，高压灭菌消毒。2 LB 固体培养基LB 液体培养基中加1.5% 琼脂

7、粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。3 0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。4 氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml 溶液，置-20 保存。5 人Bcl-2 重组质粒它是Eco R 单酶切的pBluescript KS(-) 载体与EcoR 单酶切的人Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为4 861bp ，前者是一种由pUC19 质粒衍名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - 生

8、而来的具有2 961bp 的质粒载体。因此用Eco R 酶切则应到空载pBluescript KS(-) 载体(2.96kb) 和人Bcl-2 cDNA 片段(1.9kb) 。配制成2g/1 l 。6 大肠杆菌DH5 此为DNA 扩增菌7 恒温 水浴 箱8 超净工作台9 高速冷冻 离心机10 恒温 摇床11 恒温箱12 消毒 离心管13 消毒tips 14 玻璃培养皿直径90mm 15 玻璃涂布器16 95% 乙醇17 标记笔【操作步骤】1 细菌感受态细胞的制备将 DH5 菌种 划线于LB 琼脂 板上，37 培养过夜。挑取单菌落接种于5ml LB 培养基中，37 振荡培养培养过夜。次日取菌液1

9、ml 接种至含有100ml LB 培养基的烧瓶中，37 剧烈振荡培养至约2 3h ，待A 600 值达到0.3 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 15min 。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml 离心管 中。 4 000 g ， 4 离心10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸 使最后的残留液体流尽。加预冷的已名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - 过滤除菌的0.1mol/L CaCl2 重悬菌体，置冰浴30min

10、 。 4 000 g ， 4 离心10min ，弃培养基。再加4ml 预冷的0.1mol/L CaCl2 ，轻轻重悬菌体，置4 冰箱12 16h 。2 DNA 重组子的转化大肠杆菌DH5 本实验中的DNA 重组子为人Bcl-2 重组质粒。 在无菌条件下按每管取200 l 新鲜感受态 DH5 细菌置于无菌的5ml 塑料离心管中，共2 管，分别加入人Bcl-2 重组质粒(10ng) 和消毒水( 作阴性对照) 各 5 l ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min 。42 ，热休克90s ，中途不要摇动离心管，每管加800 l 无抗生素 的 LB 培养基，于 37 空气 摇床 中以 150 r/min 速度振摇45min ，使细菌复苏。每管取200 l 加至含氨苄青霉素（Amp ）的LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min ，使液体吸收，然后37 倒置培养12 16h 至单菌落形成。【 注意事项】1 含人 Bcl-2 重组质粒的DH5 菌落平板倒置置于4 保存， 于下周进行质粒DNA 的制备名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - -