2022年分子诊断学复习资料简答题部分 .pdf

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1、简答基因组的特点：？（大题）人类基因组的特点：1、人类基因组具有23 对染色体，基因组序列大约2.9 亿个核苷酸，含有蛋白质编码基因大约20, 000-25, 000个。其中大量基因与中枢神经系统，特别是脑部发育相关；2、绝大多数基因为断裂基因，且分布不均（每条染色体具有基因富集区和基因稀疏区）。除蛋白质编码基因外，其他大量基因为RNA 编码基因；3、基因内和基因附近中存在大量短序列调控元件，发挥基因的调控表达和协调表达的作用；4、基因组（基因内）中存在大量功能未知的其他序列（“非编码DNA”），如串联重复序列、转座元件。5、序列突变是人类基因突变的重要来源，序列/基因多态性是研究人类遗传突变

2、的重要手段。6、线粒体DNA（mtDNA ）是人类母系遗传疾病的重要来源基础。真核基因组特点：1. 真核基因组结构庞大：人：3109bp 。几、十、百倍于原核。2.线性双链DNA，多条染色体和二倍体（Diploid ）： DNA 和组蛋白质形成染色体，存在于核膜内。人：23 对， 46条；3.单顺反子 (Monocistron) ：一个结构基因转录生成一条mRNA。4. 功能基因不连续性，内含子与外显子并存（断裂基因）：转录后需剪接(Splicing) 5. 非编码区多于编码序列(9:1) 6.含有大量重复序列（Repetitive Sequences): 重复次数可达数百万次，序列多态性是真

3、核生物基因组的重要特征。原核生物基因组的特点：1.基因组呈共价闭合环状双链状态，散布在细胞中，有时相对集中形成类核/拟核（ Nucleoid ）2.基因组 DNA 小，基因数目少（1500-5900 个），种间DNA 大小差异大， GC含量差异大 (菌种鉴定和分类标准），基因多为单拷贝基因（编码rRNA 、tRNA 基因多拷贝，利于核糖体的快速组装和蛋白质合成）3.基因组只有一个复制起始点，功能相关的基因大多成簇地串联排列（操纵子结构）在染色体上，结构基因无内含子，基因连续分布，为多顺反子。4.除主基因组外，原核生物往往还具有质粒基因组5.转座元件 /基因是原核生物基因组的重要特征（转座元件（

4、Tranposable Element）是指可移动的基因成分，即能在一段 DNA 分子内部或两段DNA 分子之间移动的DNA 片段，又称跳跃基因。）6.致病基因是致病原核生物基因的重要特征病毒基因组的特点：1.基因组大小相差很大（HBV：3.2kb ，痘病毒： 300kb ）2.结构分子具有多样性（DNA 病毒 /RNA 病毒，单链DNA/RNA 病毒，双链DNA/RNA 病毒，环状分子/线性分子）3.基因组多数是连续性（单一分子基因组），但RNA 病毒往往不连续（呼肠孤病毒：10 条节段双链RNA，甲乙流感病毒： 8 条单链节段RNA，丙型流感病毒：7 段单链节段RNA 。包装在同一个病毒颗

5、粒内，或在不同病毒颗粒内，只有全部基因组序列都存在，才具备感染能力）4.编码序列占基因组的90% 以上，间隔区序列很少；5.多为单拷贝（单倍体），即每个基因只出现一次（除逆转录病毒基因组有两个拷贝）；6.相关基因丛集（功能上相关的基因排列在一起）、有重叠基因和不规则基因结构序列。1、试述点突变（基因背景清楚和未知）的主要检测方法。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 13 页 - - - - - - - - - 答：对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可以采取直接

6、检测基因点突变的方法，如等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide ，ASO) 、PCR-ELISA 、等位基因特异性扩增(allele specific amplification ，ASA) 、PCR-RFLP、基因芯片技术等进行诊断，例如 地中海贫血，可以使用ASO、PCR-RFLP 联合基因芯片技术进行诊断。对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳 (denaturing graient gel electroph

7、oresis ，DEEG) 、异源双链分析(heteroduplex analysis，HA) 、DNA 序列测定、蛋白截短测试（protein truncation test ，PTT）等方法，如Hopkins 大学医学院的研究人员设计了47 对 PCR 引物，分段扩增血友病A 因子 基因片段，进行DGGE 分析，发现多态性片段后再进行DNA 序列分析，几乎查清了所有临床轻中度病人的点突变。2、试述限制性内切酶Mst切割法诊断镰状细胞贫血的原理并图示。答：在F基因区域内，有一种A 基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A 基因位于F基因的第22 号内含子内 (A1)，另外两个位于X 染色体的

8、末端 (A2 、A3)。A1 基因可以与其上游的两个A 基因拷贝中的一个发生同源重组，引起F基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致F功能完全丧失而发生严重的血友病(图 15-5)。其中与A2 发生的重组称为近端重组，约占倒位的15；与 A3 发生的重组称为远端重组，约占倒位的85。3、试述近端重组、远端重组概念。答：在 F基因区域内，有一种A 基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A 基因位于F基因的第22 号内含子内 (A1)，另外两个位于X 染色体的末端(A2、A3)。A1 基因可以与其上游的两个A 基因拷贝中的一个发生同源重组，引起F基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致F功

9、能完全丧失而发生严重的血友病(图 15-5)。其中与A2 发生的重组称为近端重组，约占倒位的15；与 A3 发生的重组称为远端重组，约占倒位的85。4、简述 TGGE/DGGE 的基本原理答：在 TGGE 中，随着温度的逐渐升高时，DNA 分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA 分子表现出一种复杂的分枝构像，使得其电泳迁移率大大下降。DNA分子的解链决定于该分子的解链温度（Tm），而 Tm 有强烈的序列依赖性，如在单取代突变中，若是A:T （两个氢键）被G:C（三个氢键）取代，将增加该双链DNA 分子的 Tm 值。而整个DNA 分子序列对解链温度也有影响，若A:T 被 T:A 替代，

10、或G:C 被 C:G 替代，分子的解链温度也会发生改变。因此不同的DNA 分子由于其Tm 不同，将于不同凝胶位置（温度不同）产生分枝（解离）使电泳迁移率降低，从而在凝胶上的不同位置形成条带。DGGE 的变性条件为热（一般为60的恒定温度）和固定比率的甲酰胺（040）、尿素（ 07M ）。这些梯度变性的功能就相当于TGGE 中的温度梯度的功能，使不同DNA 分子在不同的凝胶部位发生解链，引起迁移率下降，从而将不同的DNA 分子分离。5、简述变性高效液相色谱法检测基因变异的优点答： DHPLC 突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性。（1）DHPLC 与各种电泳法的比较SSCP 分析

11、片段长度105。根据卫星DNA 的长度，又可分成3种：卫星DNA 、小卫星DNA 、微卫星DNA 。（二）中度重复序列这类重复序列主要由比较大的片段（由100bp 到几千 bp）串联重复组成，分散在整个基因组中，重复频度不等，如 Alu 家族、 rRNA 、tRNA 和组蛋白等。20、简述质粒的概念和特性，常用的质粒载体有哪几种？质粒为细菌染色体外一些双链、共价闭合环状DNA 分子，是能够进行独立复制并保持稳定遗传的复制子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。质粒一般具有以下特性：自主复制性，它能独立于宿主细胞的染色体DNA 而自主复

12、制；质粒不相容性；可扩增性；可转移性。理想质粒载体应具备具有松弛型复制子；在复制子外存在几个单一的酶切位点；具有插入失活的筛选标记；分子量相对较小，有较高的拷贝数。常见的质粒载体有：pBR322 质粒、 pUC 质粒载体、 pGEM 系列载体等。21、试述举 2种质粒 DNA 提取的方法及应用。 答案 质粒 DNA 提取的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS 裂解法。1）碱裂解法：在NaOH 存在的强碱性（pH12.014.0）的条件下，用强阳离子去垢剂SDS 破坏细胞壁和裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA 发生变性，释放出质粒DNA 。它是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌

13、（ E.coli ）菌株中分离出质粒DNA ，制备量可大可小。2）煮沸裂解法：是将细菌悬浮于含Triton X-100 和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100 和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA 发生变性。对CCC 质粒 DNA 因结构紧密不会解链，当温度下降后，CCC 质粒 DNA 可重新回复其超螺旋结构，通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA ，然后回收上清液中的质粒DNA 。本法只能用于小质粒DNA （小于 15kb）的小量或大量制备，适用于大多数从大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒 DNA 。3）SDS 裂解法：它是将细菌悬浮于等渗的

14、蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA 处理以破坏细胞壁，再用SDS 裂解去壁细菌，从而温和地释放出质粒DNA 到等渗溶液中，然后用酚/氯仿抽提。适用于大质粒DNA 的提取。22、简述哺乳动物细胞基因组DNA 抽提的主要方法有哪几种？名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 13 页 - - - - - - - - - 本题答案 哺乳动物细胞基因组DNA 抽提的主要方法有：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法和异丙醇沉淀法、磁珠吸附法等。23、 简述从琼脂糖凝胶中回收DNA

15、片段的主要方法有哪几种？ 本题答案 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片段的方法主要包括DEAE- 纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法、冷冻挤压法及现在有试剂盒供应的以硅为基础的纯化系统等。24、简述磁性球珠分离法分离mRNA 的原理。 本题答案 磁性球珠分离法是基于寡聚(dT)与 poly(A) 的互补配对特性、用生物素标记寡聚(dT)，通过寡聚 (dT)与mRNA 3 端 poly(A) 形成杂交体，这种杂交非常迅速，在12 分钟内就可完成，可有效地除去rRNA, tRNA以及其他RNA, 而后通过生物素与链亲和素顺磁性磁珠之间的相互作用来捕获这些杂交物而达到分离纯化。25

16、、描述质粒DNA 的结构特点。多数细菌来源的质粒核酸是环状双链DNA 分子，没有游离的末端，每条链上的核苷酸通过共价键头尾相连。质粒DNA 分子通常具有三种不同的构型。当其两条核苷酸链均保持完整环形结构时，为共价闭合环状DNA 分子，这样的DNA 常以超螺旋状态存在；如果两条链中只有一条链保持完整环形结构，另一条链出现一至数个缺口时，为半开环DNA ；若两条链均有缺口并发生断裂则成为线性DNA 分子。26、试述质粒的类型有哪些？根据细菌染色体对质粒复制的控制程度是否严格可将质粒分为：严紧型质粒和松弛型质粒。按转移方式分为：接合型质粒、可移动型质粒、自传递型质粒。按质粒大小分为：小型质粒、大型质

17、粒。按质粒的宿主范围分为：窄宿主谱型质粒、广宿主谱型质粒。按质粒的功能分为：F 质粒、 R 质粒、 Col 质粒。27、线粒体 DNA 与核 DNA 有哪些不同之处？（一）非孟德尔的母系遗传。mtDNA 因位于细胞质中,表现为严格的母性遗传, 不服从孟德尔遗传，绝大部分mtDNA 是通过卵细胞遗传。（二）高突变率。mt DNA 突变率约为nDNA 的 10 100 倍，此外 mtDNA 与有毒物质的结合频率比核DNA 高数倍至数十倍。（三）异质性和复制分离。异质性即突变mtDNA 与野生型 mtDNA 以不同的比例共存于一个细胞内的现象。复制分离即在细胞分裂的复制过程中,突变的和野生型的mtD

18、NA 随机进入子细胞的过程，复制分离的结果使突变mtDNA 杂合体向突变纯合或野生纯合方向转变,但因突变复制具有优势,故易产生突变积累，突变积累的程度不同,突变mtDNA 在群体中的多态性程度也不同。（四）阈值效应。每个细胞的mt DNA 有多种拷贝，而一个细胞mt DNA 编码基因的表现型依赖于一个细胞内突变型 mt DNA 和野生型mt DNA 的相对比例， mtDNA 突变导致氧化磷酸化水平降低,当能量降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时即达到了mtDNA 表达的能量阈值，可引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状，这就是阈值效应。（五）半自主复制与协同作用。mt DNA 虽有自我复

19、制、转录和编码功能，但该过程还需要数十种nDNA 编码的酶参加，因此mt DNA 基因的表达同时也受nDNA 的制约，两者具有协同作用。28、何谓线粒体病？简述线粒体病的遗传学分类。线粒体病（ mitochondriopathy ）是指由于线粒体呼吸链功能不良所导致的临床表现多样化的一组疾病。临床表现常见为眼睑下垂、外眼肌麻痹、视神经萎缩、神经性耳聋、痉挛或惊厥、痴呆、偏头痛、类卒中样发作等。从核基因缺陷和线粒体基因缺陷的角度对线粒体病进行遗传学分类可分为三种类型：点突变，mtDNA 的大规模缺失或插入和源于核DNA 缺陷引起 mtDNA 缺失。29、病毒的基本结构成份主要有哪些？毒没有完整的

20、细胞结构，由四种基本结构成份组成：由一种核酸(DNA或 RNA) 组成的病毒基因组。由病毒基因组编码的衣壳蛋白组成的衣壳。来源于宿主细胞质膜系统（细胞膜、内质网膜或高尔基体膜）的包膜。病毒颗粒中的其它内容物，包括酶、核酸结合蛋白及金属离子等。30、国际病毒分类委员会（ICTV ）将病毒分成哪几类？名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 13 页 - - - - - - - - - 国际病毒分类委员会（ICTV ）制定了国际病毒分类 与命名原则。根据病毒的基因组 组

21、成及复制方式，可将病毒分为如下几类：DNA病毒（DNA Viruses ）第一组： 双链 DNA 病毒 （Group I: dsDNA Viruses ）第二组： 单链 DNA 病毒 （Group II: ssDNA Viruses ）RNA病毒（RNA virus es）第三组： 双链 RNA 病毒 （Group III: dsRNA Viruses ）第四组： 正链 RNA 病毒 （Group IV: (+)ssRNA Viruses）第五组： 负链 RNA 病毒 （Group V: (-)ssRNA Viruses ）DNA与 RNA 逆转录病毒 （DNA and RNA Reverse

22、 Transcribing Viruses）第六组： RNA逆转录病毒 （Group VI: RNA Reverse Transcribing Viruses）第七组： DNA逆转录病毒 （Group VII: DNA Reverse Transcribing Viruses）亚病毒因子 （Subviral Agents ）卫星 （Satellites）类病毒 （Viroids ）朊病毒（ Prions）31、简述长病毒末端重复序列的特点和作用。逆转录病毒基因组RNA 在逆转录后生成的双链DNA 中，两端有长末端重复序列（long terminal repeat ，LTR ）结构。 LTR 在

23、结构与功能上与上述重复序列不同。LTR 中的重复序列只占一部分，另外还包括单一序列。5端的 LTR包含许多特定的基因表达调控区域，是一组真核生物增强子和启动子单位，而3端的 LTR 具有转录终止的作用。另外，逆转录病毒基因组利用LTR 中的重复序列形成环状结构，在整合酶作用下整合入宿主细胞基因组内。53 蛋白质组学的研究特点有哪些？ 整体性 揭示生命的动态性过程 体现生命现象的复杂性32、等电聚焦凝胶电泳的原理是什么？依据蛋白质分子的净电荷或等电点进行分离的技术。在等电聚焦过程中，电场所采用的载体两性电解质含有脂肪族多氨基多羧酸，可在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续pH 梯度，蛋白质分子

24、在一个载体两性电解质(ampholyte)形成的连续而稳定的线性pH 梯度中电泳，当蛋白质迁移到其等电点位置时，净电荷为零，在电场中不再移动，因此可将各种不同等电点性质的蛋白质分离开来33、简述酵母双杂交系统的优缺点。酵母双杂交系统所具有的优点：蛋白质作为被研究的对象不用被纯化；检测在活细胞内进行，可以在一定程度上反映体内（细胞内）的真实情况；由于这一系统可以反映基因表达产物的累积效应，因而可检测存在于蛋白质之间微弱或短暂的相互作用；采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库，可用于分析多种不同功能的蛋白。局限性：双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相

25、互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性，这种可能还必须经过其他实验验证，尤其要与生理功能研究相结合，否则可能会误入歧途。34、蛋白质间互作鉴定：（1）蛋白质亚基的聚合：线性、环状、螺旋、球状、交叉聚合（2）分子识别：抗原与抗体、配体与受体、酶与底物（3）分子的自我装配：核糖体、细菌鞭毛、病毒的自动装配（4）多酶复合体：丙酮酸脱氢酶复合体包括丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶。蛋白质间作用力：名师资

26、料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 13 页 - - - - - - - - - （1）氢键：肽键之间，主侧、侧侧链之间（2）范德华力：取向力、诱导力、色散力（3）疏水键：非极性基团为了避开水相二群集在一起的作用力。（4）离子键（盐键）：正负离子之间的静电引力所形成的化学键。蛋白质相互作用的研究方法: 体外：（ 1）肽蛋白质亲和层析；（2）亲和印迹；（3）免疫沉淀；（4）交联等。体内：（ 1）酵母双杂交系统；（2）噬菌体展示技术；（3）生物传感芯片质谱；（4）蛋白质

27、定点诱变。蛋白组学研究内容：1.蛋白质分离；2.蛋白质的鉴定；3.蛋白质 -核酸间相互作用；4.蛋白质与蛋白质的相互作用。蛋白组学研究的特点： 1）整体性和规模化；2）动态性和网络化；3）复杂性和综合技术化；蛋白质组研究常用技术：1）蛋白质分离技术（电泳和层析技术）；2）蛋白质检测与图像分析以及鉴定技术；3）蛋白质互作研究技术；4）生物信息学分析技术。35、蛋白质组学的研究内容有哪些？蛋白质组学的研究包括两个方面：一是针对蛋白质表达模式的研究，一是在蛋白质功能模式方面的深入分析。36、PCR，聚合酶链反应（Polymerase chain reaction)：是一种模拟体内天然DNA 复制过程

28、的体外核酸扩增技术，是基因扩增技术的一次重大革新。 PCR 原理 ：利用 DNA 聚合酶催化一对引物间的特定DNA 片段在体外实现快速、大量扩增的方法，也称：无细胞克隆技术或特异性DNA 序列体外引物定向酶促扩增法。 PCR 标准反应体系（五要素,）（1）DNA 模板(template)：靶基因（2）原料： dNTPs（dATP ，dGTP， dCTP，dTTP）（3）催化酶：耐高温的DNA 聚合酶（如： Taq 酶）（4） 一对引物（ primer）：扩增序列的决定者其与靶基因两侧序列互补（5） Mg2+ 和 Buffer PCR 反应过程 - 三步曲1. 高温变性：在高温（95）下，待扩增

29、的靶DNA 双链受热变性成为两条单链DNA 模板2. 低温退火：在低温（3755）下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA 模板结合，形成部分双链3. 适温延伸：在耐热DNA 聚合酶的最适温度（72）下，以引物的3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以 5 3方向延伸，合成DNA 新链。37、PCR 衍生技术 (pcr 技术有哪些 )：逆转录 PCR、反向 PCR、巢式 PCR、标记 PCR、多重 PCR、原位 PCR、不对称 PCR、定量 PCR、锚定 PCR 38、如何提高PCR 扩增的特异性？ 升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及

30、多余的DNA 聚合酶分子参与酶促延伸的机会降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发 改变 Mg2+ 的浓度可进一步提高扩增的特异性 引物设计的特异性 减少循环次数 热启动（ Hot Start）：即首先将模板变性，然后在较高温度时加入Taq DNA 聚合酶、引物及MgCl2 等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严格性，使扩增更特异 采用两对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。39、PCR 检测技术有何临床应用：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精

31、心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 13 页 - - - - - - - - - (1)PCR 在病原微生物的检测中的应用；（2）PCR 在遗传病中的应用；（3）PCR 在肿瘤中的应用；（4）其它方面的应用： PCR 技术除用于临床诊断和治疗外，还可用于DNA 指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。40、影响 PCR 反应的因素有哪些？PCR 反应体系包含DNA 模板、寡核苷酸引物、DNA 聚合酶、 dNTP 及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR 反应产生影响。41、影响 PCR 反应的因素有哪些？PCR 反应体系包含DNA 模板、寡核苷酸引物、DNA 聚合酶、

32、dNTP 及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对 PCR 反应产生影响。42、简述 bDNA 信号放大系统的原理。分枝 DNA 是人工合成的带有侧链的DNA 片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标记物。以bDNA 为基础建立的连续放大DNA 信号以检测DNA 的技术称为分枝DNA 信号放大系统。bDNA 信号放大系统包括四种杂交探针，即目标探针、前放大体、放大体和标记探针。首先用亲和素包被微孔，加入目标探针，该组探针能与等检核酸靶序列上不同区域互补，其5 端用生物素标记，能与微孔中的亲和素高度亲和结合；再向微孔中加入待测标本，目标核酸与固定于微孔中的目标探针结合；再加入前放大体，该组探针的

33、一段能与目标核酸的不同区域互补结合，另一段与放大体（即分枝DNA ）的主链部分的序列互补结合，分枝DNA 由主链和数十根寡核苷酸组成，每个分枝上都有标记探针的杂交位点，由酶标寡核苷酸组成的标记探针与bDNA 上的互补序列结合，加入底物后最后经化学发光检测仪检测。利用bDNA 信号放大系统可在每个靶序列上结合60 300 个酶分子，而且所有杂交反应同时进行，观察到的信号与靶DNA 的量成正比，可通过标准曲线将靶DNA 定量。43、简述链末端终止法测定 DNA 序列的原理答：利用 DNA 聚合酶，以待测单链DNA 为模板，以dNTP 为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同

34、的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP ）作为链延伸终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按53方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。44、简述化学法测定 DNA 序列的基本原理答：化学法是对待测DNA 进行化学降解。在化学法的测序系统中，先对待测DNA 末端进行放射性标记，然后分成4组或 5 组互为独立的化学反应体系，每一组用不同的化学试剂特异地针对某一种或某一类碱基进行化学切割，通过化学降解后

35、产生长短不一的DNA 片段，其长度取决于改组反应所针对的碱基在待测DNA 片断中的位置，将各组反应产物通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA 的序列。45、Sanger 双脱氧链终止法,全称：双脱氧链末端合成终止法原理：利用DNA 聚合酶，以待测单链DNA 为模板，以dNTP 为底物，设立4 种互相独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）作为链延终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5到 3

36、方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。每个测序反应体系的组成：1.DNA 聚合酶； 2.单链 DNA 模板（待测片段）；3.带有 3-OH 末端的单链寡核苷酸引物；4.Mg2+ ；5.原料 -dNTPs(dATP,dGTP,dCTP 和 dTTP)；6.终止剂 -ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP 和 ddTTP)测序体系的关键成分：（1）链终止剂， 2， 3-二脱氧核糖核苷酸（ddNTPs)（2）用于测序的变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE) 胶长 40cm，厚度均匀； 4-8%丙烯酰胺； 7mol/L 尿素（3）模板，即待测序的DNA 片段（ 4）引物。酶促测序反应中，利

37、用一个与模名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 13 页 - - - - - - - - - 板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA 合成的引物（5） DNA 聚合酶（ 6）放射性同位素标记的dNTP：-35S-dNTP 焦磷酸测序技术（PSQ)：在以靶 DNA 链为模板指导核酸合成的过程中，将释放的可见光作为检测信号，从而对靶DNA 链进行实时测序的方法，是一种合成测序技术。原理：同一反应体系中由四种酶催化的级联化学发光反应，首先让测序引物与待测模板结合成杂交

38、体，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该 dNTP 与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中，并释放出等摩尔的焦磷酸基团（PPi）， PPi 最终转化为可检测的光信号，并由Pyrogram TM 转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，随后，加入下一种dNTP，继续 DNA 链的合成。产生的荧光信号自动传入分析系统，直接测读靶DNA 序列。特点： 1.无需电泳，也无需荧光标记，操作极为简便，具快速、准确、经济和实时；2.阅读能力已从100bp 至 400bp ；3.该技术具有多种不同的用途。46、简述哺乳动物细胞基因组DNA 抽提的主要方法有哪几种？哺乳动物细胞

39、基因组DNA 抽提的主要方法有：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法和异丙醇沉淀法、磁珠吸附法等。47、简述重组DNA 技术的原理及技术。重组 DNA 是在体外利用限制性内切酶，将不同来源的DNA 分子进行特异的切割，获得的目的基因或DNA 片段与载体连接，从而组成一个新的DNA 分子。重组的DNA 分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，并在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量的目的基因或DNA 片段。经重组的DNA 分子能在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质。大致步骤包括：目的基因的获取；载体的选择；目的基因与运载体连接成重组 DNA ；重组DNA 导入受种细胞；重组体的筛选49、简述黏性末

40、端DNA 重组体的构建过程。目的基因和载体可由同一种限制酶切割后产生，或由不同的限制酶切割形成互补黏性末端，经退火，彼此间很容易按碱基配对原则形成氢键。然后由DNA 连接酶催化连接接头处的缺口，形成重组质粒。载体DNA 在限制酶切割后，用碱性磷酸酶处理，除去5 端磷酸基，以避免载体DNA 自身环化。50、举例说出重组DNA 技术在医药领域的应用。可以利用重组DNA 技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；开发基因工程药物和疫苗用于临床；建立基因诊断、治疗技术，为疾病的预防、治疗提供新方法、新技术。具体可用于基因诊断：基因诊断是从基因水平上检测人类遗传性疾病的基因缺陷；基因治疗：是指将人的

41、正常基因或有治疗作用的基因通过载体导入人体靶细胞取代靶细胞中的缺陷基因，从而达到治疗疾病目的的方法；基因工程药物、疫苗和抗体的研究和制备；利用基因敲除或转基因技术可改造生物、培育新的生物品种或用于药物筛选和新药评价等。51、基因芯片的主要类型及其特点（1）从支持物来分薄膜型：聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜玻片型：生产此类产品的公司如 Affimetrix（ 2）从点阵的制备方法来分原位合成型（In Situ Synthesis ） 合成点样型（off-chip synthesis） （3）根据探针片段长度分Oligo-Chip ：约 825nt，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）

42、和测序cDNA-Chip ：5000nt，基因组结构分析（4）根据用途分：基因变异检测芯片表达谱芯片功能基因芯片. 52、生物芯片 ： 采用平面微细加工技术（光导原位合成或微量点样等）将大量生物样品（核酸、多肽、细胞、组织切片等）有序地固化于支持物表面（玻片、硅片、尼龙膜等）由此组成的密集二维生物样品的微阵列。原理：分子间特异的相互作用生物芯片技术的特点：1）高度交叉的综合性新技术；2）高度集成性、微型化和连续化；3）高通量； 4）通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法，可使该技术具有多种不同的应用价值。基因芯片：1）基因芯片：有序地、高密度地排列着大量的基因片段（probe)的载体 (玻

43、璃片或纤维膜等)。2）基因芯片技术：将大量核酸探针分子固定于支持物上，标记的样品分子按碱基互补原则与探针进行杂交，通过检测杂交信号分布和强度、进而获取关于样品分子的序列和数量的信息，是高通量研究基因表达、突变等的革命性技术。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 13 页 - - - - - - - - - 基因芯片检测的原理和步骤：原理：将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的待测样品进行杂交，通过检测杂交信号的分布和强度，实现对样品中基因信息的定性和定量分

44、析。基本步骤 ：1. 芯片制备。 2.靶核酸制备（样品提取纯化、扩增和标记）3.靶核酸与探针（芯片）杂交4. 杂交结果的扫描5.图像分析和数据处理基因芯片的特点：1. 微型化和自动化；现有芯片面积：最大525cm,最小 1cm样品 DNA 的用量： 5nl/阵点杂交和洗片等过程自动化 ,工作效率极高。2. 高度平行性；实验组和对照组的样品等都在同一张芯片上同时进行杂交分析,结果的可比性好。3. 巨大的信息产出率；芯片上各点所对应的基因或其表达的定性（量）分析、差异表达分析等。4. 高度敏感性和专一性；能可靠并准确检测出10pgDNA/ L 样品。 5. 可反复使用；一张由尼龙膜制作的微阵列，可

45、以重复杂交使用多达 20 次。53、简述蛋白芯片的原理及应用。蛋白质芯片的基本原理是采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于固相介质上形成的生物分子点阵，在待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子发生杂交或相互作用或其他分离方式分离后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析。蛋白质芯片是将整个蛋白质水平的相关生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成份进行高通量检测。蛋白质芯片技术是一种快捷、高效、高通量、并行、微型化和自动化的蛋白质分析技术，适用于分析包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品能分析包含针对信号传导、癌症

46、、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，灵敏度高达pg/ml。54、举例说明基因芯片在临床诊断中的应用。基因芯片作为一项现代化的诊断新技术在感染性疾病、遗传性疾病的诊断和耐药性检测等方面已显示出良好的应用前景。下面举例说明基因芯片在疾病诊断的应用。（1）感染性疾病的诊断。性传播疾病、肝炎等。（2）遗传性疾病的诊断。地中海贫血、血友病、婚前检查等。（3）耐药性检测。结核分支杆菌耐药性检测芯片等。55、试述基因芯片的工作原理及制备。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，

47、通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。在一块1cm2 大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至万计的基因，以此形成一个密集的基因方阵，实现对千万个基因的同步检测。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。56、试述生物芯片的种类及主要功能。生物芯片根据其结构特点，可以将生物芯片分为微阵列芯片和微流体芯片两个主要类别。微阵列芯片是由生物材料微阵列构成的芯片，包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等，由于它们的工作原理都是基于生物分子之间的亲和结合作用，如核酸分子的碱基配对作用，抗原和抗体的结合等，所以通常也称为亲和生物芯片。微流芯片是以各种

48、微结构为基础的芯片，利用它可实现对各种生化组分的微流控操作和分析，这类芯片的代表有毛细管电泳芯片、 PCR 反应芯片、介电电泳芯片等。(生物芯片发展的最终目标是将各种生物化学分析操作的整个过程，从样品制备、生化反应到结果检测，都集成化并缩微到芯片上自动完成，以获得所谓的微型全分析系统（micro total analysis systen,-TAS） ,或称“微缩芯片实验室”（lab-on-a-chip ）。微缩芯片实验室代表了生物芯片技术发展的未来。)57、核酸探针 ： 序列已知的、能与待测的靶核酸序列互补结合、并带有可检测标记的核酸片段。（它可以是整个基因，或基因的一部分；它可以是DNA

49、或 RNA ）。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 13 页 - - - - - - - - - 58、基因组DNA 探针 ：为某一基因的全部或部分序列。缺点：真核基因组含有内含子序列；因此，当其用于检测基因表达时，杂交效率低cDNA探针 ：从已构建的cDNA 文库中筛选和分离出来的靶基因序列。cDNA 探针无内含子序列，尤其适用于基因表达的检测，目前应用最广。59、基因组探针和cDNA 探针的共同优点：制备方便：克隆于质粒载体中稳定：DNA 探针较 RNA

50、 探针稳定；RNA 易被 RNA 酶降解标记方法成熟和多样。共同缺点：双链探针存在自身复性，影响杂交效率。60、RNA 探针的优点 ：单链：杂交时不存在第二条链的竞争（自身复性），杂交效率高；含RNA 的杂交体更稳定（Tm 更高），杂交反应可以在更为严格的条件下进行，因而RNA 探针杂交的特异性高主要缺点：探针不稳定，易被RNase降解。 RNA 探针适合于： Northern 杂交、原位杂交等。61 原位杂交的基本原理样本经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与组织、细胞中待检测的核酸进行特异性结合形成杂交体，然后通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成的杂交信号，在显