等电聚焦电泳ppt课件.ppt

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1、等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳IsoelectricIsoelectric Focusing Focusing ElectrophoresisElectrophoresis，IEFEIEFE一、一、IEFE IEFE 定义定义 IEFE一种利用具有一种利用具有pH梯度梯度的的支持介质分离支持介质分离等点电不同等点电不同的蛋白的蛋白质的电泳技术。质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点各种蛋白质各自都有一个等电点, ,在在一特殊的一特殊的pHpH环境中环境中, ,蛋白质分子呈电中性蛋白质分子呈电中性, ,在电场中不会迁移。在电场中不会迁移。 等电聚焦等电聚焦就是在电泳介质中放入就是在电泳

2、介质中放入载载体两性电解质体两性电解质，当通以直流电时，两性，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的加的pHpH梯度，在此体系中，不同的蛋白梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。焦电泳。二、二、IEFEIEFE的的特点特点（一）优点（一）优点n1.分辨率高（精密度可达分辨率高（精密度可达0.01pH单位），单位）， 灵敏度高（最低检出量达灵敏

3、度高（最低检出量达0.1ng）。）。n2.电泳区带相当狭窄。电泳区带相当狭窄。n3.重复性好。重复性好。（二）缺点（二）缺点n1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。白质可能发生沉淀。n2.样品中的成分必须停留在其样品中的成分必须停留在其pI，不适用不适用 在在pI不溶或发生变性的蛋白质。不溶或发生变性的蛋白质。 分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高，特更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。同的生物大分子。三、三、IEFE的基本原理的基本原理蛋白质分子在不同蛋白质分子在不同pH下的解离状态

4、下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2P P P COOH COO- COO- pHpI pHpI pH pI 在电泳介质中放入载体两性电在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加质形成一个由正极到负极逐渐增加的的pHpH梯度，正极附近是低梯度，正极附近是低pHpH区，负区，负极附近是高极附近是高pHpH区。区。蛋白质分子的电聚焦过程蛋白质分子的电聚焦过程 + pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn- a b c a.蛋白质分子在负极端b.蛋白质分子在正极端c.蛋白质样品中各组分聚焦成区带 + 在这个从正极到负极p

5、H逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 进行进行IEFEIEFE必须具备必须具备3 3个条件：个条件： 有一个在电泳条件下基本稳定、重有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的复性良好的pH梯度梯度有一个抗对流的电泳材料，使已经有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合分离的样品不再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带区带（一）（一）pH梯度的建立梯度的建立 用多种用多种两性电解质两性电解质混合物建立稳定混合物建

6、立稳定良好的良好的pH梯度梯度1.理想的载体两性电解质理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：应具备的特征：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；化学性质稳定；各成分的各成分的pI彼此接近，并在其彼此接近，并在其pI值附近有良好值附近有良好的缓冲能力；的缓冲能力；在在pI处具有足够的电导，导电性均匀；处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多；两性电解质载体的数目要足够多；可溶性好；可溶性好；对对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。不

7、干扰样品的测定。2.载体两性电解质的合成载体两性电解质的合成本质：一系列本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸脂肪族多氨基多羧酸同系物同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的近相互连接的pI值。值。pH范围：范围：pH310丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）加成反应3.pH梯度的形成梯度的形成 载体两性电解质是一系列不同载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物分子的两性电解质的混合物, ,在通电在通电后，它们各自迁移到适当位置形成后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的一个连续的pHpH梯度。梯度。 pH梯度形成的过程梯度形成的过程

8、没通电时的变化没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。荷为零。引入电场时的变化引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。时才停止。 其次一些低其次一些低pIpI的载体两性电解质分子（荷的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到

9、它的净其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。电荷被减少到零才停止。电泳结束后的变化电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加所有的载体两性电解质分子以增加pIpI级数级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个位置而给出一个pIpI梯度。梯度。电解槽中，通电后，正负两极都会发生电电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：极反应：正极端反应：正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-负极端反应：负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH- 在负极引起在负极引起pH值的升高，在正极值的升高，在正极pH下降，另外在

10、电极槽的正极端放的是酸下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近在电极附近pH的急剧变化。（图的急剧变化。（图a） pH+-a 由于载体两性电解质是一系列不同由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为设其中某一成分为A，它的它的pI=pH，当当环境中的环境中的pHpH时，它带负电荷，朝正时，它带负电荷，朝正极移动。极移动。(图图b)pH+-bpH=pHA- 当环境当环境pI95% 6.87 95% 6.87HbA2 HbA2 2 22 2 2-3% 7.

11、38 2-3% 7.38HbF HbF 2 22 2 2% 6.98 2% 6.98HbA3 6.87HbA3 6.87HbAHbA 正常成人血中主要的正常成人血中主要的HbHb成分。成分。HbAHbA2 2 正常成人正常成人HbHb中的一个次要成分，当中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到胎儿出生时，其浓度不到1%1%，以后，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 2.2% 至至2.6%2.6%左右，最高范围一般左右，最高范围一般 不超过不超过3.5%3.5%。 HbF HbF 18661866年发现，是胎儿和初生儿的年发现，是胎儿和初生儿的HbH

12、b的的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%70-80%为为HbFHbF，其余为其余为HbAHbA。婴儿出生后婴儿出生后不久，不久，HbFHbF的浓度迅速减少，同时的浓度迅速减少，同时HbAHbA相相应增多，绝大多数正常人于出生后应增多，绝大多数正常人于出生后6 6个月个月至至2 2年后，年后，HbFHbF便降至成人的正常浓度，便降至成人的正常浓度，以后以后HbFHbF一直存在。一直存在。器材器材n电泳仪电泳仪n凝胶玻管凝胶玻管n三角烧杯三角烧杯n10cm长针头长针头试剂试剂 n分离胶缓冲液分离胶缓冲液nAcr-BisnTEMED、APnAmpholinen电极缓冲液（电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）操作操作1.凝胶的制备凝胶的制备 2.电泳电泳 3.剥胶剥胶 4.观察结果观察结果 思考题思考题1.PAGE与与IEFE有何区别？有何区别？2.本实验的关键步骤是什么？本实验的关键步骤是什么？