RIP实验技术5页word.doc

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流RIP实验技术【精品文档】第 5 页【实验技巧】RIP实验技术RIP实验技术导语近年来，长非编码RNA（lncRNA）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncRNA，但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。 下面我们来介绍一下RIP技术。RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP（RNA immunoprecipitation），可以说是RNA版的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。在RIP试剂盒（如Sigma的

2、Imprint RNA Immunoprecipitation kit）的帮助下，研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。不论是细胞质还是细胞核，都会发生RNA与蛋白的相互作用。据Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp介绍，该公司的RNA ChIP-IT kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用DNAse I处理，最后利用磁珠进行沉淀。“如你研究的是总mRNA，那么常规RIP试剂盒更合适一些，”

3、Hondorp说，“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”生产Magna RIP RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布，该产品有化学交联与native两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以帮助人们捕

4、捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化，不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息。据伦敦大学学院的Jernej Ule教授介绍，CLIP与RIP的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记，并将这些复合物进行SDS-PAGE分离，之后转移到一张膜上。这样

5、的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来，用于制备cDNA文库，以备测序分析。“CLIP要比RIP麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”Ule说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高cDNA文库的质量，最终得到准确实用的数据。”一. 细胞裂解液获取A. 单层细胞或者贴壁细胞处理1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管3. 1500rpm，4离心5min，弃上清，收集细胞4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min5. 每管分装200l细胞裂解液

6、，贮存于-80B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解C. 组织样品处理1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数3. 1500rpm，4离心5min，弃上清，收集细胞4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min5. 每管分装200l细胞裂解液，贮存于-80二. 磁珠的准备A. 实验前准备1、enpendoff管2、磁力架3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上4、抗体，置于冰上5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水B. 磁珠准备过程1. 重悬磁珠2.

7、 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3. 吸取50l 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管4. 每管加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡5. 将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次6. 用100l的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中7. 室温孵育30min8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清9. 加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次10. 加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于

8、冰上三. RNA结合蛋白免疫沉淀A. 准备工作1、冰盒2、360旋转仪3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4离心10min。吸取100l上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml4. 4孵育3h至过夜5. 短暂离心，将enp

9、endoff管放在磁力架上，弃上清6. 加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次四、RNA纯化A. 实验前准备1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶2. Salt Solution、Salt Solution、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇4.DEPC水置于冰上5. 离心机预冷6. 冰盒B. RNA纯化过程1.准备Proteinase K Buf

10、fer。每个样品需150ul2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物3. 55孵育30min4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中5. 于每管上清液中加入250lRIP Wash Buffer6. 于每管加入400l苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min7. 小心的吸取350l上层水相，吸入另一新的enpendoff管8. 于每管加入400l氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min9. 小心的吸取300l上层水相，吸入另一新的enpendoff

11、管10. 每管加入50l Salt Solution，15l Salt Solution,5l Precipitate Enhancer ，850l 无水乙醇（无RNase），混合，-80保持1h至过夜11. 14,000rpm，4离心30min，小心去上清12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4离心15min，小心去上清，空气中晾干.13. 10-20l DEPC水溶解，-80保存，送测序RIP实验常见问题1：RIP试验需要注意什么?(1)防止RNA与蛋白非特异性结合。(2)避免RNA蛋白质结合被破坏。(3)避免外源RNAse污染。(4)抑制内源RNase的活性。(5)选择适合做

12、RIP的抗体。(6)避免RNA结合蛋白的降解。2：为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白?(1)先进行IP或者WB，测试抗体可以与目标RBP结合。(2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。(3)尽可能选用密理博RIPAb+抗体。(4)稀释抗体成浓度梯度，进行IP测试。(5)4过夜孵育抗体与RIP裂解液。(6)确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。3：提取RNA时，蛋白酶k消化不完全是什么原因?当进行蛋白酶K消化时，确保水浴温度应设置在55左右，长期在65以上孵育会导致蛋白酶K失活。4：提取RNA后，A260/A280比值偏离1.82.2区域是什么原因?(1)需要缩短酚氯

13、仿提取RNA的时间间隔。(2)测试提纯后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA发生了降解。5：做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应50 ul BEADS?50 ul beads对应的是一个reaction，而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清(2107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到)，所以只需要在裂解前计数一下，并按括号中的比例加入裂解buffer，后续100 ul 裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋

14、白浓度的方法进行配比。6：RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗?理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。7：因为RIP做完得到的是RNA序列，要做后续检测，比如测序、判断目标序列位置等，是不是都必须要做RT-PCR，得到逆转录的DNA后，后面就跟ChIP相同了?常见的用real time qRT-PCR。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量，理论上说，使用input作为判别，计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看IgG以及目的抗体富集的非特异性mRNA的量的话，那么可以找一个确定不会与目的抗体结合的RNA片段设计primer进行qPCR，用来看IgG以及目的抗体拉下来的背景情况。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等)