生化复习题 (1).doc

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生化复习题 (1)【精品文档】第 10 页生化习题考试时间：6月11日（周三）晚上18：30-20：30 地点：禧强楼-203题型：名词解释10个，共20分。简答题6个，共30分。论述题5个，共50分。一、糖蛋白和蛋白聚糖1、糖链的一、二、三、四级结构的概念（1） 一级结构：单糖残基的组成、排列顺序、相邻单糖残基的连接方式、异头物的构型及糖链有无分支、分支的位置和长短等。（2） 二级结构：多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体,关系到多糖分子中主链的构象,不涉及侧链的空间排布;（3） 三级结构：多糖链一级结构的重复顺序,由于糖残基中的羟基、羧基、氨基以

2、及硫酸基之间的非共价相互作用,导致有序的二级结构空间形成有规则而粗大的构象;（4） 四级结构：多糖链间非共价键结合形成的聚集体。2、 糖蛋白、蛋白聚糖、O-连糖蛋白、N-连糖蛋白、糖组学等概念（1） 糖蛋白 Glycoproteins: 由寡糖链和多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白。糖含量1%80%。寡糖链不多于15个单糖残基。（2） 蛋白聚糖 proteoglycan : 含大量糖胺聚糖并与多肽骨架连接的高分子物质。糖含量95%（3） 连接糖蛋白：糖蛋白糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基的羟基相连，称为O-连接糖蛋白。（4） N-连接糖蛋白：糖蛋白的糖链与蛋白部分的Asn-X-Ser序列的天

3、氡酰胺氮以共价键连接称N-连接糖蛋白。（N-连接糖蛋白的糖基化位点为Asn-X-Ser/Thr）（5） 糖组学(糖蛋白) Glycomics ：涉及单个个体的全部糖蛋白结构分析，确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的机制。3、 糖蛋白中糖链的生物学功能分子间：细胞-细胞间识别、粘附和结合病原体, 趋靶于组织。分子内：蛋白质的正确折叠、细胞内定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半寿期、蛋白酶敏感性等；介导专一的“识别”和“调控”生物过程。 糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用：1) 去糖基化的蛋白不能正确折叠维持亚基正常构象； 1-抗胰蛋白酶(不能折叠) 疱疹口炎病毒（VSV）的G蛋白(不能形成

4、正确二硫键) 流感病毒红细胞凝集素（HA,一种糖蛋白）用糖链合成抑制剂衣霉素后，肽链部分正常合成，糖链部分不能合成，糖蛋白不能正常折叠，不能形成三聚体，不能被分泌到胞外。 2) 寡聚蛋白中的糖链能影响亚基的缔合亚基间通过糖链相互识别而发生缔合。运铁蛋白受体二聚体跨膜糖蛋白，6条糖链，Asn251去糖基化，不能形成二聚体，影响受体的转运和功能,而且在细胞内迅速被蛋白酶水解。糖链影响糖蛋白的稳定性1) 极性糖链有助于蛋白质的溶解2) 真核细胞中表达的糖蛋白在原核细胞内聚集成包涵体糖链对糖蛋白分拣、投送和分泌的作用1) 去糖链的免疫球蛋白不能分泌到胞外；2) N-聚糖中的甘露糖-6-磷酸结构是糖蛋白

5、分拣到溶酶体中的标志，用衣霉素处理细胞阻止N-糖化，可使很多定位于细胞膜上的糖蛋白减少。糖链参与分子识别和细胞间识别（识别功能）1） 糖链与精卵识别 透明带糖蛋白ZP-3上的O-GalNAc卵子凝集素受体精子 花粉表面糖蛋白柱头表面受体2） 糖链和细胞粘着 多细胞生物中细胞有相互识别聚集成细胞群的能力细胞粘着 细胞外基质(ECM)：糖蛋白（层粘连蛋白 laminin、胶原Collagen、纤粘连蛋白 Fibronectin ）、氨基聚糖及蛋白聚糖 膜内在蛋白：整联蛋白、钙粘着蛋白等3） 糖链与血浆中老蛋白的清除(5)糖链与糖蛋白的生物活性1） 糖链与酶活性-葡萄糖苷酶去糖链影响； 酵母羧肽酶去

6、糖链无影响2） 糖链与激素活性腺垂体促激素类：促卵泡激素、促黄体激素、促甲状腺激素等糖链末端结构不同，与受体亲和力不同。肾脏红细胞生成素（4条N糖链，二、三、四天线）四天线越多，体内活性越高。3） 糖链与IgG活性IgG缺外链Gal自身抗原被免疫系统识别产生自身抗体自身抗体与缺外链Gal 的IgG生成免疫复合物关节内炎症(6)糖类和血型物质(7)毒素受体功能、细胞内运输功能、开关与调节功能4、 蛋白聚糖中常见的糖胺聚糖的种类(糖胺聚糖：由己糖醛酸或半乳糖与氨基己糖构成的二糖单位重复几十到几百次组成的线性糖链。)体内重要的糖胺聚糖（6种）： 透明质酸(hyaluronic acid, HA) 硫

7、酸软骨素(chondroitin sulfate) 硫酸皮肤素CS(dermatin sulfate, DS) 硫酸角质素(keratan sulfate, KS) 硫酸乙酰肝素/肝素(heparan sulfate, HS/heparin, Hep)5、 蛋白聚糖的生物学功能构成细胞外基质：在基质中蛋白聚糖和弹性蛋白、胶原蛋白以特殊方式连接，构成基质的特殊结构。这与细胞的粘附、迁移、增殖和分化等有关。其它功能：抗凝血（肝素）参与细胞识别结合与分化（细胞表面的硫酸素）维持软骨机械性能（硫酸软骨素）等二、蛋白质空间结构1、 蛋白质的生物学功能 酶的催化功能 结构功能：collagen （胶原蛋白

8、）、elastin （弹性蛋白）、keratin （角蛋白）、fibroin （蚕丝蛋白）、proteoglycan （蛋白聚糖） 运输功能：Transport within or between different cells or tissues（不同细胞或组织之内/之间的运输）Transport into or out of cells（运输进入或出去细胞） 储藏功能：ovalbumin（卵清白蛋白）、casein（酪蛋白）、zein（玉米蛋白）、ferritin（铁蛋白） actin（肌动蛋白）、myosin（肌球蛋白）、tubulin（微管蛋白）。（肌球蛋白和肌动蛋白是包含在肌肉丝状

9、蛋白分子。在钙离子（底部）的存在，肌球蛋白和肌动蛋白会滑过对方，形成跨桥梁，从而收缩肌肉。） 调节功能：To regulate the ability of other proteins（调节其他蛋白质的活性） 激素：insulin ( 胰岛素) 、somatotropin (生长激素)、thyrotropin (促甲状腺素）To regulate the gene expression（调节基因表达）Positively（正调节）：AP1 Negatively（负调节）：NF1、 lac repressor (乳糖抑制体) 防御功能：脊椎动物利用抗体防御（也就是中和抗原） 2、 蛋白质各级空

10、间结构的概念及这些空间结构的关系一级结构：蛋白质多肽链的氨基酸残基的排列顺序。二级结构：指肽链的主链在空间的排列，或规则的几何走向、旋转及折叠。（转角、折叠片 、螺旋、自由回转 ）。超二级结构(supersecondary structure)：是指蛋白质若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。（，）结构域（domain）：多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，具有部分生物功能的结构。反平行螺旋结构域反平行折叠片结构域平行或混合型折叠片结构域富含金属或二硫键结构域。三级结构(Tertiary

11、 Structure)：在二级结构基础上，肽链不同区段的侧链基团相互作用,在空间进一步盘绕、折叠形成包括主链和侧链构象在内的三维结构。四级结构：一些特定三级结构的肽链通过非共价键而形成的大分子体系的组合方式。3、 蛋白质一级结构测定的基本步骤 测定蛋白质分子中多肽链的数目： 根据蛋白质N-端或C-端残基的摩尔数和蛋白质相对分子质量确定蛋白质分子中的多肽链数目。 单体蛋白质只含一条多肽链，则蛋白质的摩尔数与末端残基的摩尔数相等； 如果蛋白质分子是由多条多肽链组成，则末端残基的摩尔数是蛋白质的摩尔数的倍数。 肽链的拆分： 非共价键连接：尿素或盐酸胍处理 通过-S-S-交联：尿素或盐酸胍存在下，过量

12、的-巯基乙醇处理 测定每条多肽链中氨基酸组成： 水解（酸，碱水解，特殊基团的保护）， 衍生（荧光胺, 茚三酮，PTC-aa法等）， 色谱（离子交换层析，HPLC,气相层析） 分析多肽链的N-末端和C-末端：建立两个重要的氨基酸序列参考点。1） N末端分析：sanger反应；丹磺酰氯（DNS）法；Edman反应，(PITC法)N端标记； 双标记法（DABITC/PITC）易于操作，批量处理4-N,N/-二甲氨基偶氮苯-4-异硫氰酸苯酯/异硫氰酸苯酯2） C末端分析： 肼解法 还原法羧肽酶法 肽链的部分降解和肽段的分离 降解：酶解法、化学法 肽段分离：凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换柱层析、HPLC等

13、测定每个肽段的氨基酸顺序：改进Edman降解法，用荧光基团或有色基团标记PITC，提高测定灵敏度（DABITC/PITC）质谱法(mass spectrography)：气质联用（GCMS），液质联用（HPLC和质谱）确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序(片段重叠法)。确定原多肽链中二硫键的位置4、 获得蛋白质一级结构的方法有哪些，各有何优缺点 质谱分析方式 (分析2D得到的蛋白) 缺点：蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。质谱测序现在仍很难被应用于未知

14、蛋白的序列测定。优点：可用于蛋白质的纯度鉴定；分子量测定；肽链氨基酸排序；肽（质谱）分析；二硫键数目和位置、乙酰化、糖基化、磷酸化以及非共价结合等。 蛋白质N-末端序列 (Edman降解 ) 确定新的蛋白质，通过DNA重组技术构建寡核苷酸探针；根据免疫学机理制备抗多肽的抗体 N末端15个序列的测定，很大程度上排除了蛋白质混淆的可能性 分子克隆技术和快速DNA序列分析手段 测序速度较慢(50AA/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对末端保护的肽链则无法测序.5、 测定蛋白质三维空间结构的方法有哪些？ X-衍射技（80-85%

15、）：X-射线在晶体上散射 核磁共振技术（NMR）（15-20%） 电镜三维重构、各种光谱技术 显微技术和计算机模拟6、 多肽链折叠的空间限制因素 一个具有生物活性的蛋白质多肽链在一定条件下往往只有一种或很少的几种构象。肽键带有双键的性质，主链上1/3的键不能自由旋转。不是任意二面角（，）所决定的肽链构象都是立体化学所允许的。二个肽平面旋转时受到-C原子上侧链R基空间位阻（大小、亲水性、电荷相吸或排斥等）的影响。7、 球状蛋白质的结构特点球状蛋白质分子含多种二级结构元件球状蛋白质三维结构具有明显的折叠层次球状蛋白质分子是紧密球状或椭球状实体疏水侧链分子内部，亲水侧链分子表面（水溶性蛋白）球状蛋白

16、质分子表面有一个空穴（裂沟、凹槽），常为活性部位8、 脂类锚定蛋白的特点和分类 特点： 许多情况下通过脂锚钩与膜连接来调节蛋白活性 具有瞬时性，能可逆地与蛋白质连接和脱离。为蛋白质对膜的亲和性提供了一个 转换装置，参与膜外信号的转导 非跨膜的整合蛋白：脂类锚定蛋白共价结合于疏水碳链 分类：（共价结合的疏水碳链） N-豆蔻酰锚定蛋白(cAMP依赖蛋白、G蛋白) 硫醚异戊二酰锚定蛋白（Rho蛋白） S-脂肪酰化锚定蛋白（病毒表面糖蛋白、转铁蛋白受体） GPI（糖基磷脂酰肌醇）锚定蛋白三、蛋白质分离纯化1、 蛋白质分离纯化的基本原则根据蛋白质的溶解性、分子大小、电荷、特殊的亲和力的差异进行分离纯化。

17、 利用溶解度差别分离 盐析常用的盐为硫酸铵(温度、pH、蛋白质浓度)：高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性，从而将蛋白质从溶液中析出。 低温有机溶剂沉淀法(甲醇、乙醇、丙酮) 等电点沉淀法(适用于在等电点pH稳定的蛋白质) 根据分子大小不同分离 透析法Dialysis：蛋白质分子不能透过半透膜，而使其与小分子化合物（无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等）分离。 超过滤法：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质留在半透膜上，以达到浓缩和脱盐的目的 凝胶过滤法 密度梯度离心法（density gradien

18、t） 利用蛋白质所带电荷分离 离子交换层析：利用物质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的目的，属于吸附层析。 电泳技术：带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。 （聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、等电聚焦、双向电泳）亲和层析法：利用生物大分子和其他物质(配基)进行特异性又可逆的结合这一性质，对这些生物大分子物质进行层析分离的方法。疏水层析和反向层析：疏水层析：蛋白质具有亲水与疏水两重性，如果在层析基质上接上疏水的基团，就能在一定条件下与某些蛋白质的疏水基团相互作用，使之吸附，而达到分离纯化的目的。反向层析(反相色谱,reverse phase ch

19、romatography)是液相色谱分析中最常用的技术。 四、泛素介导的蛋白降解1、泛素介导的蛋白质降解过程如何进行？需要哪些物质的参与，它们各自的作用是什么的活化：泛素端的连接到泛素活化酶E1的巯基，这个步骤需要以ATP 作为能量，最终形成一个泛素和泛素活化酶E1之间的硫酯键。E1将活化后的泛素通过交酯化过程交给泛素E2。 泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白质上并释放E2，形成特定的的蛋白质。 泛素化的蛋白质被特定的识别并结合，最终在蛋白酶的催化下蛋白质分解为短肽或。需要的物质及其作用：E1泛素激活酶：E2泛素结合酶：E3泛素连接酶：在底物的特异性选择降解过程中作最为关键成员。HE

20、CT结构域能接受从E2转移而来的泛素分子形成E3-Ub复合物。环指结构域它们起着将底物蛋白与E2-Ub靠近的作用，从而使得E2-Ub复合物上的泛素能高效地转移到底物蛋白上。DUB脱泛素酶：泛素C-末端水解酶-多聚泛素基因表达产物的C-末端额外短肽的去除，以及泛素延伸蛋白中泛素单体与核糖体蛋白的分离。泛素特异性加工酶-从泛素上除去蛋白。五、蛋白质的变性、复性及蛋白质折叠1、蛋白质变性的概念、变性蛋白的特点、变性的化学本质蛋白质变性的概念：由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化 ，这种现象称为蛋白质的变性(denaturatio

21、n)。变性蛋白的特点：生物活性丧失抗原性改变理化性质改变：溶解度下降（沉淀）、结晶能力丧失、特性粘度增加、扩散速度下降等生化性质改变：易被蛋白质水解。变性的化学本质：天然蛋白质分子从紧密有序的结构松散无序结构的过程。涉及构象变化，二硫键的断裂及侧链基团的化学修饰2、蛋白质折叠的学说 经典的蛋白质折叠自组装学说由Anfinsen等根据对RNase复性研究的经典实验提出来的经典的“热力学假说”认为，天然蛋白质多肽链采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件（如溶液组分、PH、温度、离子强度等）整个系统的总自由能最低，所以处于变性状态的多肽链在一定的

22、环境条件下能够自发折叠成天然构象。许多蛋白（特别是一些小蛋白）在体外可以可逆的进行变性、复性，使“热力学假说”得到了广泛的支持。 Ellis的“辅助性组装学说”体内蛋白质的折叠往往需要有其他辅助因子的参与，并伴随有ATP的水解。因此，Ellis于1987年提出了蛋白质折叠的“辅助性组装学说”。这表明蛋白质的折叠不仅仅是一个热力学的过程，显然也受到动力学的控制。“辅助性组装学说”认为，蛋白质多肽链的正确折叠和组装并非都能自发完成，在相当多的情况下是需要其他蛋白质分子的帮助，这类帮助蛋白包括分子伴侣与折叠酶。新的观点在实质上并不和Anfinsen理论相矛盾，属于蛋白质折叠途径或折叠的识别和组装问题

23、上的认识的完善，为揭示生理或病理条件下蛋白质的折叠机理提供了新的研究思路，因而具有重要的理论意义和潜在的应用价值。3、蛋白质折叠需要哪些助折叠蛋白，它们各自的作用是什么辅助蛋白： 分子伴侣（molecular chaperons）：一类相互之间没有关系的蛋白质，他们的功能是帮助含多肽结构的其他物质在体内进行正确的非共价的组装，但不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能的组成部分。 折叠酶（Foldase）： 蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase PDI）：催化巯基的氧化、二硫键还原、二硫键之间的交换、脯氨酸羟化酶的亚基、甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基、糖基

24、化位点结合蛋白。 肽基脯氨酸顺反异构酶（peptidyl proly cistrans isomerase PPI ）：催化脯氨酸亚氨基的肽键异构化为顺式。六、酶1、酶的概念、酶活性部分的概念、酶活性部位的特点、酶活性部位的研究方法酶的概念：酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。酶活性部分的概念：即活性中心。是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。酶活性部位的特点：总体积很小，占整个酶分子体积的1%-2%。活性部位是一个小的空间区域。活性部位与底物的形状不是正好互补。活性部位位于酶分子表面的一个裂缝(crevice) 。E与S结合成ES主要靠次级键。酶

25、活性部位具有柔性或可运动性。酶活性部位的研究方法：化学修饰法X-射线衍射法动力学参数测定法基因定点突变法等2、酶降低活化自由能的因素 邻近和定向效应 酶使底物分子中的敏感键产生“变形”（或张力） 共价催化形成共价中间物 酸碱催化 活性中心部位的疏水环境效应3、米氏方程及Km、Kcat的含义米氏常数Km：酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。v = 1/2 Vmax, Km = SKcat转换率：表示酶被底物饱和时每个酶分子在单位时间内能使底物转化为产物的最大分子数催化常数。4、酶抑制作用的分类及相关的概念不可逆抑制作用：1）专一不可逆抑制：作用于酶的一类或几类基团，这些基团中包含

26、了必需基团，作用后引起酶的失活。2）非专一不可逆抑制：a）Ks型不可逆抑制剂亲和标记试剂 具有和底物相似的基团，可以和相应酶的结合基团结合，同时还带有一个活泼的基团，可以和酶活性部位的其他功能基团起反应，对后者进行化学修饰，从而抑制酶的活性。b）kcat型不可逆抑制剂被酶激活的不可逆抑制剂（酶的自杀性底物）I 以潜伏态存在，在无酶的情况下不反应必需通过它的靶酶专一被激活反应中，酶激活了这种无活力的潜伏态不可逆抑制剂，自身的活力则完全丧失自杀性底物可逆抑制作用：1）竟争性抑制：抑制剂的化学结构类似过渡态底物，则对酶的亲和力就会远大于底物，从而引起酶的强烈抑制。2）非竟争性抑制：非竞争性抑制剂存在

27、时，Vmax值减小，Km值不变。3） 反竟争性抑制：E只有与S结合后才能与I结合，形成不能分解的ESI三元中间产物，导致酶促反应被抑制I的存在加强了E、S的结合； 反竞争性抑制剂存在时，Km和Vmax值均减小5、酶活性的调节方式别构调节酶原激活可逆共价修饰调节七、RNA研究1、 RNA的分类及相应的概念RNA的分类： 编码蛋白mRNA（只包括mRNA的编码区） 非编码蛋白RNA（持家RNA调控RNA）持家RNA：在生命活动过程中，长期恒定表达，其功能是维持基本生命所必需的。调控RNA：表达有时空特异性，常常是短暂表达；在生物的不同层面上调控：如不同的发育分化阶段、不同性别、不同组织与细胞系、不

28、同生理状态调控；常与生物的适应性反应及应急性反应有关。2、 RNA的功能RNA在遗传信息的翻译中起着决定的作用：mRNA：信使(messenger)和模板(template) tRNA：转运(transfer)和信息转换(adaptor)rRNA ：装配 (assembler)和催化(catalyst)RNA具有重要的催化功能（核酶）：.分子内催化：RNA合成后的加工（自我切割、拼接、环化） .分子间催化(核酶复合物) ：核糖核蛋白复合物RnaseP核糖体（肽基转移酶）拼接体编辑体信号识别颗粒（复合物中RNA单独有催化功能） 其他持家功能：tmRNA破损mRNA蛋白质合成的终止gRNARNA编

29、辑RNA编辑的意义：校正功能：消除移码突变等基因突变的危害扩充遗传信息量：增加了基因产物的多样性调控翻译：构建起始密码和终止密码RNA编辑还可能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化RNA编码还可能与学习和记忆有关对基因表达和细胞功能的调节作用：反义RNA改变靶部位构象影响其功能siRNA及micRNA调节mRNA的翻译oxySRNA抗氧胁迫，多效，抗突变roX1RNA激活雄性X染色体转录活性XistRNA哺乳类雌性两性X染色体之一失活RNA在生物进化中起重要作用3、 RNAi研究的基本步骤确定目的基因根据相应的核酸序列设计出siRNA的序列获得siRNAsiRNA序列进入细胞检测RNA

30、干扰效果八、信号转导1、受体的主要特征是什么？ 高度特异性 高度亲和力 可饱和性 可逆性2、细胞表面受体的种类有哪三种？ 离子通道型受体G蛋白偶联型受体具有酶活性的受体3、G蛋白在植物细胞信号转导中的作用 光信号转导 G蛋白参与光敏色素调节过程，因此参与了红光信号的转导 离子通道蚕豆保卫细胞中K通道是受G蛋白负调控， 植物激素信号转导 植物病原信号转导中可能有G蛋白参与4、 叙述异三聚体G蛋白参与细胞外信号跨膜转换的过程外部的细胞信号（电、光、磁激素，神经递质与神经肽，局部化学介导因子、气体信号分子等第一信使） 受体跨膜信号转导 胞内信号 （cAMP、cGMP、Ca2+、IP3、DG等第二信使） 蛋白质的可逆磷酸化 生理功能调节，基因表达调控当受体与其相应配体结合后，诱导a-亚基构象变化，促进GDP和GTP变换，需要Mg。GTP的结合导致a-亚基与b，r-亚基分开，并且激活G蛋白亚基和br复合物，激活的a-亚基并作用于靶蛋白，激活靶蛋白，产生胞内信使，引起各种细胞反应（开启K离子通道）。a-亚基有GTP酶活性，在Mg存在下水解GTP，产生的a-亚基与GDP复合物重新b，r-亚基结合，是G蛋白失活，重新形成失活的G蛋白和失活的靶蛋白（关闭钾离子通道）。