最新哺乳动物细胞表达重组蛋白PPT课件.ppt

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1、按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统分为:原核表达系统原核表达系统酵母酵母表达系统表达系统植物植物表达系统表达系统昆虫昆虫表达系统表达系统 哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高， 与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物 学功能 内含子内含子 某些内含子有重要的基因功能调控序列某些内含子有重要的基因功能调控序列,目的基因以基目的基因以基因组形式克隆入载体能得到高表达。因组形式克隆入载体能得到高表达。 为增加转录产物的稳定性为增加转录产物的稳定性,表达载体中一般含有天然的表达载体中一般含有天然的或人工合成的内含子序列。或人工合成的内含子序列。转录终止序列转录终止序列 真核基因的真核基因的hnRNA的加

2、工过程需要的加工过程需要PolyA信号信号,在目的基在目的基因因3端加上端加上PolyA,表达水平提高表达水平提高10倍以上。倍以上。SV40的早期的早期和晚期和晚期PolyA.分泌表达载体 二、宿主细胞二、宿主细胞 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以下条件：以下条件： 细胞系特征细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征， 便于大规模培养。便于大规模培养。 遗传稳定性遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，：外源基因多次传代后不至于丢失， 易于长期保存。易于长期保存。 合适的标记合适的

3、标记：便于转化株的筛选和维持。：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。：不合成分泌致病物质，不致癌。 哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，常用的细胞系有常用的细胞系有 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 人胚肾细胞HEK293 中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞人胚肾细胞（ HEK293

4、）的优势贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养。在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度较低的培养基中。具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性三、培养工艺三、培养工艺 为了减少成本和节约时问，近年来发展了大规模悬浮培养细胞瞬时转染技术 常用的商业化的离了脂质转染试剂，转染效率很高，但价格不菲 目前有两种试剂(磷酸钙和聚乙烯亚胺)可用以满足大规模培养瞬时表达利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 采用无血清无蛋白培养基无血清无蛋白培养基(SFMPFM)来降低细胞培养和产品纯化的成本。双无

5、培养基 但SFMPFM缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中细胞常表现出活力降低、贴壁性差等现象，进而导致分泌目的蛋白的能力下降。 通过将生长刺激因子、黏附因子基因导入CHO细胞中，让CHO细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在SFMPFM中生长良好。抑制细胞凋亡，延长培养周期抑制细胞凋亡，延长培养周期 细胞在大规模培养初期， 目的蛋白的表达和细胞的增殖速率呈正相关。 但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐凋亡，重组蛋白表达量逐渐降低。 减少代谢产物的积累、在细胞密度达到理想值时使细胞处于增殖遏制期以及提高细胞的抗凋亡能力是宿主细胞改造的重要方向。 通过降低产生代谢废物的基因的表达量或提高细胞的抗凋亡能力，都可以提高细胞的抗逆能力进而提高目的基因的表达。24 结束语结束语