最新双向电泳实验步骤幻灯片.ppt

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1、双向电泳实验步骤双向电泳实验步骤双向电泳一、双向电泳原理一、双向电泳原理二、双向电泳样本制备二、双向电泳样本制备三、第一向电泳三、第一向电泳IEFIEF电泳电泳四、胶条平衡四、胶条平衡五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE六、双向电泳凝胶染色六、双向电泳凝胶染色七、双向电泳图片分析七、双向电泳图片分析 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663Alklysis buffer(LB)ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris20mMThiourea (FW 76

2、.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction bufferReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSucrose (FM 342.30）0.7MKCl（FM 74.55）0.1MEDTA（FM 292.25）50mMTris（FM 121.14）0.5MHClTo pH7.5醋酸铵甲醇溶液醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanolAmmonium acetate in methanol用甲醇配制0.1M的醋酸铵二、双向电泳

3、样本制备二、双向电泳样本制备 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663三、第一项电泳三、第一项电泳IEFIEF电泳电泳1：蛋白质定量,根据定量所得的数据吸取相应量的蛋白质，分析胶的一般上样量为银染120g，考染600g，质谱胶的一般上样量为银染200g，考染1200g。将所有样品稀释成5g/L 。2：每根胶条的上样液的成分为：相应量的蛋白质、1%DTT、1%IPG Buffer、1溴酚蓝、RB调制最终体积至460L。将样品溶液混合均匀后，4 12000r/min，离心20min，吸取上清液450L进行泡胀。3：取出水化盘，在底下铺上白色纸巾（方便观

4、察胶条泡胀情况），调节水平备用。从冰箱取出干胶条复温（如不复温胶条会吸潮）。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，450L样液可分3枪加入，第一二枪每枪吸160L，从槽顶端开始，沿左右边缘加入，将样液加成一条细线，长约22cm，第三枪吸至管中样液剩余20L左右即可，加至槽的顶端，将顶端部分覆盖满。调节室内温度为20，让胶条泡胀过夜（1012h），4：等点聚焦（IEF),等电聚焦程序为：S1 stp 300V 20min, S2 stp 700V 30min, S3 stp 1500V 1.3h, S4 grd 9900V 3h, S5 stp 9990V 5.3Hr, S6 stp 600V

5、 20h5：跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，胶条应置于-20保存。如果需要运输，则要用冰完全包埋平衡管保温。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663四、胶条平衡四、胶条平衡1 1：作用：作用 DDT与IAA联合使用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带上负电荷以利于第二向SDS-PAGE电泳。2 2：实验步骤：实验步骤 （1）：取出放置有胶条的平衡管，每管加入10mL左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，去掉去离子水。 （2）：SDS平衡液加入100mM DTT混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15mi

6、n，去掉平衡液。 （3）：SDS平衡液加入250mM IAA混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （4） SDS 平衡液： 50mM Tris-HCl (pH8.8)， 6M Urea (FW 60.06)，30%(v/v) Glycerol (87% v/v)，2% (w/v) SDS (FW 288.38)，0.002%(w/v) Bromophenol blue。 注：在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE

7、电泳电泳1 1、根据实验分离片段大小选择不同浓度的、根据实验分离片段大小选择不同浓度的PAGEPAGE胶：胶：2 2、配制、配制12.5%SDS-PAGE12.5%SDS-PAGE凝胶：凝胶：ReagentsReagentsVolumn of reagentsVolumn of reagents123456Monomer solution50.04 ml75.06 ml100.08 ml125.1 ml150.12 ml175.14 ml4 resolving gel buffer30ml45 ml60 ml75 ml90 ml105 ml10%SDS1.2ml1.8 ml2.4 ml3.0

8、ml3.6 ml4.2 mlDouble distilled water38.16ml57.24 ml76.32 ml95.4 ml114.48 ml133.56 ml10%ammonium persulfate600l900 l1.2 ml1500 l1800 l2.1 mlTEMED39.6l59.4 l79.2 l99 l118.8 l138.6 lTotal volumn120ml180 ml240 ml300 ml360 ml420 ml五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳30%T,2.6%C Monomer stock solution：Reagen

9、tReagentFinal concentrationFinal concentrationAcylamide (FW 71.08)30%N,N-methylenebisacrylamide (FW 154.17)0.8% 0.2m膜过滤，4保存4 4 Resolving gel buffer Resolving gel buffer：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris-base (FW 121.1)1.5MHCl (FW 36.46)To pH8.8 0.2m膜过滤，4保存10% SDS：ReagentReagen

10、tFinal concentrationFinal concentrationSDS (FW 288.38)10%0.2m膜过滤，室温保存 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 3 3、灌胶：灌胶： 灌胶时使胶液沿着灌胶口斜面的厚塑料垫板流下，动作均匀，灌至液面到灌胶口平为止。迅速在胶面上加入水饱和正丁醇压平液面，加入时使枪头贴着玻璃长板缓慢划动均匀加入，当所有玻璃板加完2mL后，在玻璃板和灌胶器的缝隙处也各加入2mL使内外液面相平，然后再加正丁醇至没过短板为止。蒙上保鲜膜过夜

11、。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663 4: 4: 电泳电泳 （1）用1x电泳缓冲液配制1%的低熔点琼脂糖45mL，1%的普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1X后放于泡沫盒中备用，吸取低熔琼脂糖封住SDS-PAGE整个胶面。迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡。 （2）依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，避免玻璃板下端产生气泡。装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1%普

12、通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电。在上槽中轻轻地加入上槽液（2 x 电泳缓冲液）至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液（1 x 电泳缓冲液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电泳。电泳条件为， 2W/gel 45min后改为17W/gel继续电泳，当BPB跑出二向胶以后可停止电泳。 10 SDS 电泳缓冲液，1% SDS，250mM Tris-base，1.92M Glycine。 300 X 溴酚蓝储存液，1% 溴酚蓝， 50mM Tris-base。五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务

13、热线：免费服务热线：400-699-1663六、染色六、染色1 1、考染：、考染： （1） 电泳结束后，用塑料尺子将玻璃板翘开，轻轻取下胶条，拨走胶面的琼脂糖，并用塑料尺子在胶面的酸性端切一个小角。用去离子水冲洗玻璃板下表面和胶面，并将挤瓶头伸至胶下冲洗，使胶稍微脱离玻璃板，将玻璃板反扣到染色盘上，让胶依靠重力慢慢脱离玻璃板落入染色盘中。 （2).染色：固定 40%MeOH+10%HAc 30min-over night。 漂洗 H2O 15min X 4次。 染色 室温摇荡过夜 终止 H2O漂洗至背景清楚。 （3）.染色液：（0.12%G-250,10% 100mlH3PO4,10%（NH4

14、）2SO4, 20%MeOH)。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663六、染色六、染色2 2、银染：、银染：注：为了与质谱鉴定相兼容，敏化步骤不加戊二醛，银染步骤也不加入甲醛。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663七、图片分析七、图片分析目前常用于常规双向电泳图片分析软件： （1）IamgeMaster (GE) （2）PDQuest(Bio-Rad) 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663THANKS!