RNA-的提取琼脂糖电泳及RTPCR.ppt
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1、目的目的 DNA片段片段 质粒质粒 TA载体载体连接连接 重组质粒重组质粒目的目的 DNA转化转化无质粒的无质粒的E.Coli 死亡死亡有质粒的有质粒的E.Coli 存活存活含抗生素培养基中生长含抗生素培养基中生长PCR 2-3min平板筛选平板筛选 实验内容实验内容1、小鼠肝脏组织总、小鼠肝脏组织总RNA的提取;的提取;2、RNA的琼脂糖凝胶电泳;的琼脂糖凝胶电泳;3、以总、以总RNA为模板的逆转录反应;为模板的逆转录反应;4、以、以cDNA为模板的特定基因的为模板的特定基因的RT-PCR: 注:本次实验扩增注:本次实验扩增GAPDH基因基因(746bp)5、 PCR产物的电泳及回收产物的电
2、泳及回收(8:058:15)教师要有下午电泳时教师要有下午电泳时 播放的多媒体播放的多媒体 PCR Flash 动画动画 PCR在法医学上的应用在法医学上的应用RNA提取操作注意事项提取操作注意事项 RNA RNA分离的关键因素是减少分离的关键因素是减少RNARNA酶污染。酶污染。 RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐耐热、耐酸、耐碱,不需要辅助因子就具有活性作用。酸、耐碱,不需要辅助因子就具有活性作用。 1、尽量避免外
3、源性、尽量避免外源性RNase 污染污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。(试剂应该专用)用新开封的化学试剂。(试剂应该专用) c.一次性塑料器材最好是新开封并经过一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭水处理及高压灭菌。菌。 d.玻璃器材、水都应该经过去玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。璃器材还应该进行高温烘烤。 2、应用、应用RNase 抑制剂抑制内源性抑制剂抑制内源性RNase 活性活性。 总总RNA 真核细胞的真核细胞的RNA主要分为:主要分为: 1、mRN
4、A: 1-5% 起始密码:起始密码:AUG 终止密码:终止密码:UAA,UAG,UGA。 5鸟嘌呤鸟嘌呤7位甲基化位甲基化CH3修饰。修饰。 1)免受核酸酶破坏,)免受核酸酶破坏, 2)起始、促进蛋白质合成。)起始、促进蛋白质合成。 3poly(A)尾巴结构尾巴结构 20-200个个A. 翻译所必需。翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基小亚基40S: 18S=1874nt1 1)将)将1 ml Trizol 1 ml Trizol 试剂分装到试剂分装到Eppendor
5、f Eppendorf 管中备用。管中备用。2 2)实验教师操作实验教师操作: : 取新鲜小鼠肝脏组织,组织块不宜过取新鲜小鼠肝脏组织,组织块不宜过大大, ,放在玻片上立即研磨放在玻片上立即研磨, ,研磨研磨要彻底要彻底。 3 3)将研磨后的组织()将研磨后的组织(小米粒大小小米粒大小)转移至)转移至1 ml Trizol 1 ml Trizol 试剂中,盖紧盖,上下颠倒混合试剂中,盖紧盖,上下颠倒混合2 min2 min以上,使组织细胞以上,使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4 4)室温孵育)室温孵育10 min10 min。(8
6、:159:05)发放口罩,帽子,每个组来一个人领取。发放口罩,帽子,每个组来一个人领取。强调肝脏组织块不宜过大强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。研磨要彻底。第一部分:提取小鼠肝脏组织的总第一部分:提取小鼠肝脏组织的总RNA1、异硫氰酸胍法:、异硫氰酸胍法: GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂,能够裂解细胞的同时,是一种强的蛋白质变性剂,能够裂解细胞的同时,还能有效地抑制内源性还能有效地抑制内源性 Rnase的活性,通过有机溶剂的分步抽的活性,通过有机溶剂的分步抽提,可获得纯度较高的细胞总提,可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点:需低温操作,但价格经济。特点:需低温操作,但价格经济。2、Tri
7、zol 试剂试剂(商品化产品)(商品化产品) 特点:在室温下可以提取细胞总特点:在室温下可以提取细胞总RNA, 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。3、mRNA提取试剂盒提取试剂盒 真核细胞真核细胞mRNA的的3末端有末端有ploy(A)尾,利用寡聚尾,利用寡聚 dT纤维素纤维素结合结合mRNA,将其从细胞总,将其从细胞总RNA中分离出来。中分离出来。课间介绍课间介绍 RNA提取的几种方法提取的几种方法室温孵育室温孵育10 minRNase抑制剂介绍抑制剂介绍1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐二乙基焦炭酸盐 RNA操作时最常用的操作时最常用的RNase抑
8、制剂,对核酸酶有抑制剂,对核酸酶有 很强的抑制很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合,使蛋白质变性。作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合,使蛋白质变性。 使用方法:用来去除溶液中的使用方法:用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中提取中 所有液体试剂都应该用所有液体试剂都应该用DEPC处理。处理。 有效浓度:有效浓度:0.05%-0.1%,室温磁力搅拌,室温磁力搅拌20分钟。分钟。 灭活条件:高压消毒,或灭活条件:高压消毒,或70 C 1 h。 在在Tris溶液中半衰期为溶液中半衰期为1.25min。 储存方法:不能用聚苯乙烯器皿。储存方法:不能用聚苯乙烯器皿。4 C ,或液氮中
9、。,或液氮中。2、肝素、肝素 使用浓度:使用浓度:0.110mg/ml 效效 果果: 37 C 时,可抑制时,可抑制95%的的RNase 活力。活力。 如果与如果与DEPC联合应用,联合应用, 具有极强的抑制具有极强的抑制 效果。效果。 室温孵育室温孵育10 min 结束结束5 5)加入)加入200 200 l l氯仿,震荡混匀氯仿,震荡混匀20-30 s20-30 s,室温放置,室温放置5 min5 min (此期间液体开始分层,不要轻易搅动液体)(此期间液体开始分层,不要轻易搅动液体) 10, 000 rpm10, 000 rpm,离心,离心 5 min (5 min (统一离心统一离心)
10、 ) 7 7)将清澈透明的)将清澈透明的上层水相上层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。9:0510:05RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein第一部分:提取小鼠肝脏组织的总第一部分:提取小鼠肝脏组织的总RNA RNA提取提取:RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein8 8)沉淀)沉淀RNARNA:加:加0.5 ml0.5 ml异丙醇异丙醇,上下颠倒混匀,室温,上下颠倒混匀,室温10 min10 min。 10, 00010, 000 rpmrpm,4 4 C C,( (统一统一) ) 离心离心10 min10 min,弃上清。,弃上清。1010)加)加1ml 75
11、%1ml 75%乙醇乙醇洗涤。洗涤。1111)7500rpm7500rpm,4 4 C C 离心离心 1 min1 min,弃上清,弃上清 再离心几秒钟,将管壁液体完全移净。再离心几秒钟,将管壁液体完全移净。在用在用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时,全程均在室温进行,当时,全程均在室温进行,当RNA沉淀用水溶解后,沉淀用水溶解后,应该注意在冰上操作,而且尽可能快地进入下一个环节。应该注意在冰上操作,而且尽可能快地进入下一个环节。离心离心10分钟时分钟时课间休息课间休息注意:注意:75%乙醇的作用:不起沉淀作用,只是为了清洗管壁加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入,
12、不要搅动沉淀缓慢加入,不要搅动沉淀12)室温干燥)室温干燥35 min(根据(根据RNA沉淀大小决定,干燥后的沉淀沉淀大小决定,干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状,避免过分干燥应该是无色胶样透明状,避免过分干燥,此此步骤非常关键步骤非常关键。)。)注意事项注意事项:RNA:自然室温干燥避免放在37oC孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥,微量乙醇残留,容易造沉淀必须绝对干燥,微量乙醇残留,容易造成成RT的失败,但过分干燥又是造成的失败,但过分干燥又是造成RNA不溶解不溶解的主要原因的主要原因 。判断。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键
13、环节。干燥后的是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。沉淀应该是无色胶样透明状。RNA pellet:乳白色,透明胶样乳白色,透明胶样干燥后无色透明干燥后无色透明13)用加样器吸取冰冷)用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 18 l,加到,加到RNA上,进行吹打上,进行吹打溶解溶解RNA 沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNA应置冰上保存应置冰上保存。14) 14) 吸出吸出 9 9 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用( (将用于电泳将用于电泳).).15) 15) 剩余剩余 9 9 l l溶液溶液, ,放到冰上备用(用于放到冰上备用(用于RTRTPCRPCR). .RNA
14、的溶解:的溶解:v注意:注意: RNA沉淀的溶解一定要耐心沉淀的溶解一定要耐心充分,充分,一定一定要用加样器要用加样器反复反复多次吹打方多次吹打方可。但由于溶液体积非常小,要避免出可。但由于溶液体积非常小,要避免出现气泡影响现气泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法:避免气泡的方法:用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度:判断溶解程度:吹打时液体流动不拐弯吹打时液体流动不拐弯为止。为止。 逆转录酶:逆转录酶: 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC,禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶,形成与RNA碱基相互补DNA链
15、,后者称为互补DNAcDNA。 RNAaseH的活性:切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。 RT第二部分:逆转录反应第二部分:逆转录反应 (RT)AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT 按照下列配方进行按照下列配方进行RNA的的RT反应:反应:第一步:第一步:总总RNA 9 l Oligo dT (0.05 g/ml) 1 l (终:终:2.5 ng/ml) 轻弹管底混合,轻弹管底混合, 置置65水浴水
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