最新医学分子生物学 -第二章 rna-2ppt课件.ppt

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1、一、一、RNA干扰（干扰（RNA interferenc，RNAi）的发现）的发现 1990年，年， Napoli矮脚牵牛花实验矮脚牵牛花实验Plant Cell,1990 三、三、RNA干扰机制干扰机制1、启动阶段：、启动阶段：dsRNA被被Dicer逐步切割成逐步切割成siRNA （ small interfering RNA ） 2、效应阶段、效应阶段: Risc形成：形成： siRNA与蛋白质聚集形成与蛋白质聚集形成Risc （ Risc，RNA-induced silencing complex） Risc激活：激活： siRNA双链解开。双链解开。 激活的激活的Risc定位到同源定

2、位到同源mRNA上，上， 降解该降解该mRNARiscRiscRisc53四、四、RNA干扰过程中的关键元件干扰过程中的关键元件1. dsRNA（double strand RNA） RNA病毒：病毒：ssRNAdsRNARNA指导的指导的RNA聚合酶（聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）RdRp3OH5p5p3OH3OH5pRdRp 人工导入人工导入dsRNA2. DicerRNase III家族成员核酸内切酶，特异性识别并切割家族成员核酸内切酶，特异性识别并切割dsRNA dsRNA结合结构域结合结构域（ dsRNA-binding domain,d

3、sRBD）RNase III催化结构域催化结构域解旋酶结构域（解旋酶结构域（helicase domain）dsRNAsiRNADicera front view of the crystal structure of Giardia intestinalis Dicer ATP依赖依赖PAZ结构域结构域3. siRNA duplex结构：双链结构：双链3端突出端突出2个核苷酸个核苷酸2125个核苷酸个核苷酸3OH5p5p3OH21 nucleotides2 nt overhang 4. Risc（RNA-inducing silencing complex）RNA诱导的沉默复合物诱导的沉默复

4、合物组分：组分： siRNAAgo（Argonaute protein family）结合募集）结合募集siRNARNA helicase（RNA解旋酶）形成单链解旋酶）形成单链siRNARiscRisc正义链正义链反义链反义链反义链反义链激活的激活的RiscATP依赖依赖RNase（内切酶、外切酶）切割目标（内切酶、外切酶）切割目标mRNA3OH5pRisc反义链反义链降降 解解5. RdRp（RNA dependent RNA polymerase）RNA依赖的依赖的RNA聚合酶聚合酶放大效应：微量放大效应：微量siRNA，明显干扰效应，明显干扰效应可能机制：可能机制： siRNA 重复利

5、用重复利用3OH5pRdRpRisc反义链反义链激活的激活的Risc53Dicersecondary siRNAprimary siRNAmechanism of RNAi脱靶效应（脱靶效应（off-target） 正义链干扰正义链干扰 正义链修饰正义链修饰 反义链反义链seed-region活性活性反义链修饰反义链修饰 剂量依赖剂量依赖 cocktail smart poolRiscRiscATP依赖依赖（+）（-）（+）（-）Risc（-）mRNARisc（+）on-targetoff-target正义链干扰正义链干扰目标目标mRNA非目标非目标mRNA反义链反义链seed-region活

6、性活性（+）（-）5533seed region 27 核苷酸核苷酸（-）RiscmRNAmRNAmRNARiscRisc335535目标目标mRNA非目标非目标mRNA五、五、RNA干扰研究的一般技术路线干扰研究的一般技术路线1、目的基因的确定、目的基因的确定2、siRNA序列的设计序列的设计3、获得、获得siRNA产物产物4、siRNA转移转移5、RNA干扰效果检测干扰效果检测siRNA序列的设计：序列的设计：一般设计原则一般设计原则（1）从）从mRNA 的的AUG起始密码子（避开起始密码子（避开5和和3端的非翻译区）开始，寻找端的非翻译区）开始，寻找“AA” 二连序列，并记录其二连序列，

7、并记录其3端的端的19个碱基序列，作为潜在的个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。靶位点。 GC含量在含量在30%50%左右的左右的siRNA为宜。为宜。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除可能的同源序列。）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除可能的同源序列。（3）选出合适的靶序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的）选出合适的靶序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，找到最有效的找到最有效的siRNA序列。序列。 （4）设置合理的阴性对照：）设置合理的阴性对照：scramble siRNA 与与siRNA组成相同，但序列不同。组成相同，但

8、序列不同。获得获得siRNA产物产物（1）化学合成已知有效的）化学合成已知有效的siRNA。（2）体外转录筛选）体外转录筛选siRNA。（3）Dicer（RNase III）降解）降解dsRNA快速经济地研究某个基因功能。快速经济地研究某个基因功能。2001000nt体外转录体外转录dsRNA目的基因目的基因DicersiRNA mixture（4）siRNA表达载体表达载体（5）siRNA表达框架表达框架siRNA转移转移（1）脂质体介导的转染）脂质体介导的转染（2）病毒介导的感染）病毒介导的感染（3）电穿孔）电穿孔RNA干扰效果检测干扰效果检测（1）mRNA：RT-PCR、定量、定量PCR

9、、Northern 。（2）蛋白质：）蛋白质：Western、ELISA、免疫荧光、免疫荧光（3）生理生化表型参数：）生理生化表型参数：六、微小六、微小RNA（microRNA，miRNA）1、miRNA：广泛存在于真核细胞中的一组短小的、：广泛存在于真核细胞中的一组短小的、 不编码蛋白质的不编码蛋白质的RNA家族，由约家族，由约22nt组成的单链组成的单链RNA。2、miRNA的发现：的发现：The C. elegans heteroch ronic gene lin24 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-141

10、993年，年，Lee et al，Cell线虫，线虫，lin-4 lin-142000年，年，Reinhart et al，Nature 线虫，线虫，let-7The 21nucleo tide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans拟南芥，水稻拟南芥，水稻斑马鱼，果蝇斑马鱼，果蝇鼠，人鼠，人3、miRNA的成熟：的成熟： 长的内源性转录本（长的内源性转录本（pri-miRNA） 70nt 茎环结构茎环结构miRNA前体（前体（pre-miRNA） miRNA双链双链 miRNA单链单链- Risc复

11、合物复合物micro RNA基因组基因组pri-miRNApre-miRNApre-miRNAmiRNA duplexDicer单链单链miRNADrosha RNaseRisc活化活化miRNA胞核胞核胞浆胞浆Exportin53553miRNA duplexRisc（+）（-）Risc（+）（-）目标目标mRNA354、miRNA与目标与目标mRNA的作用模式：的作用模式： 3UTR 不完全互补，抑制翻译。不完全互补，抑制翻译。 编码区完全互补，降解编码区完全互补，降解mRNA。（类似。（类似siRNA与目标与目标mRNA的结合与降解）的结合与降解） 上述两种模式均具备。上述两种模式均具备

12、。55、miRNA的生理功能：的生理功能：时空性表达（组织特异性和阶段特异性）时空性表达（组织特异性和阶段特异性） 控制个体发育控制个体发育353lin-4：第一、二期：第一、二期let-7：第三、四期和成虫期：第三、四期和成虫期 miRNA 产生：产生： 基因组（正常）基因组（正常）来源：来源： 内源转录本内源转录本直接来源：直接来源： 发夹状发夹状pre-miRNA 结构：结构： 单链单链互补性：互补性： 不完全互补或完全互补不完全互补或完全互补特异性：特异性： 相对较低相对较低 作用部位：作用部位： 3UTR 或编码区或编码区 对基因的影响：对基因的影响： 抑制翻译或降解目标抑制翻译或降

13、解目标 mRNA 生理功能：生理功能： 调节内源基因的表达调节内源基因的表达 控制个体发育控制个体发育 siRNA 病毒感染、转座子移位、导入病毒感染、转座子移位、导入dsRNA（异常）（异常） 病毒病毒RNA或转基因（外源）或转基因（外源） 长链长链dsRNA 单链单链 完全互补完全互补 较高较高 编码区或编码区或UTR 降解目标降解目标 mRNA 抵抗病毒感染、抑制转座子活性抵抗病毒感染、抑制转座子活性miRNA与与siRNA的比较：的比较：均为均为Dicer的切割产物：长度均为的切割产物：长度均为22nt左右左右 siRNA duplex miRNA duplex均需均需Argonaut

14、e家族蛋白的存在，同为家族蛋白的存在，同为Risc的组分的组分 两者进化关系上可能的推论：两者进化关系上可能的推论：siRNA是是miRNA的补充的补充 miRNA在进化中替代了在进化中替代了siRNAmiRNA与与siRNA的联系：的联系：七、反义七、反义RNA（antisenseRNA）从基因组中非编码区转录的一段从基因组中非编码区转录的一段能与目标能与目标mRNA序列互补配对的单链序列互补配对的单链RNA，可阻断该目标可阻断该目标mRNA翻译成蛋白质。翻译成蛋白质。siRNAmiRNAantisenseRNA来源来源外源外源基因组基因组基因组基因组长度长度2130nt22nt更长更长配对配对严谨严谨不严谨不严谨严谨严谨方式方式转录后转录后翻译、转录后翻译、转录后 复制、转录（后）、翻译复制、转录（后）、翻译29 结束语结束语