最新十章节蛋白质和氨基酸测定一节概述ppt课件.ppt

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1、食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。蛋白氮多的要单测）。蛋白质是生命的物质基础，人体蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。只是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量

2、与蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。分解产物直接影响食品的色、香、味。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定1. 消化消化 总反应式：总反应式：加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓

3、硫酸（一定要用浓硫酸（98%） 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。钛。 加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。物氧化速度。仪器：仪器：219页页 要防止爆沸。要防止爆沸。另外：介绍另外：介绍“自动回流消自动回流消化仪化仪”2. 蒸馏蒸馏 消化液消化液 + 40%氢氧化钠加热氢氧化钠加热蒸馏，放出氨蒸馏，放出氨气。气。3. 吸收与滴定吸收与滴定用

4、用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。甲基红。 指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸） 用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再用用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。指示剂。吸收吸收滴定滴定 操作方法：操作方法：158页，其中讲页，其中讲“以奈氏试以奈氏试 剂剂”检查氨是否全部蒸完，检查氨是否全部蒸完，以

5、奈氏试剂以奈氏试剂Nessler试剂，试剂，K2（HgI4） 检验检验NHNH4 4+ +离子，遇铵根，离子析离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。出黄色或红棕色沉淀。配制配制方法方法1 1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 2 溶于溶于70 70 毫升毫升水。加水。加3030毫升毫升4 mol/L4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。方法方法2 2、 溶解溶解11.5 g HgI11.5 g HgI2 2 + KI 10 g+ KI

6、10 g于适量少于适量少许水，后加水稀释至许水，后加水稀释至50 ml,50 ml,静置后，取其澄清液，静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。弃去沉淀，储存于棕色瓶中。 结果计算：结果计算：158页页 注意：注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.25 也可查表。也可查表。 说明：说明： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。在的情况下消化不

7、完全而造成氮损失。 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。化完全。 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧当样品消化液不

8、易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入瓶冷却，加入30过氧化氢过氧化氢 23 m1 后再继续后再继续加热消化加热消化。 若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试可按每克试样样5 m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但

9、含铁量多时，呈较深消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。绿色。 蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在氢氧化铜在7090时发黑。时发黑。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。吸收液倒吸。二、二、 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量

10、法不同点：加入硼酸量加入硼酸量有有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。可用微量滴定管。3、蒸馏装置见、蒸馏装置见 159 页图页图 10-2 。10-210-2三、三、 自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消分钟可消化完毕。化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收

11、和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司产品名称：产品名称： 凯氏定氮仪凯氏定氮仪 二、双缩脲法二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、紫外分光光度法、 染料结合法、染料结合法、 水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。1.原理原理脲（尿素）脲

12、（尿素）NH2CONH2 加热至加热至150160时，时，两分子缩和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2

13、+ NH3NH2CONH2 + NH2CONH2注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化样品不用消化2. 方法特点及应用范围方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3.主要仪器：主要仪器： 分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂：试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液碱性

14、硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳四氯化碳5操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线标准样绘标准曲线。三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，R R（ NHCHCO NHCHCO）对紫外光有吸收作用在对紫外光有吸收作用在280 nm280 nm下，吸光度与蛋白下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。质浓度成直线关系，求含量。2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。素多，故在食品分析领域应用不广泛。3 3主要仪器：主要仪器

15、： 紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（离心机（3000 5000 r/min3000 5000 r/min）4 4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线第五节第五节 氨基酸的定性测定氨基酸的定性测定 利用各种显色反应（利用各种显色反应（170174页）。页）。第六节第六节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法 1.1.原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性 NHNH2 2 基，又有基，又有 酸性酸性 COOH COOH 基，成中性内盐，加入甲醛基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，与溶液后，

16、与 NHNH2 2 结合，碱性消失，再结合，碱性消失，再用强碱来滴定用强碱来滴定 COOH COOH 基。基。2 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）中游离氨基酸的测定） 3 3双指示剂：双指示剂： 40% 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将氢氧化钠将40%40%甲醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。 0.1% 0.1%百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液， 0.1% 0.1%中性红中性红50%50%乙醇溶

17、液，乙醇溶液， 0.1 mol/L 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。4 4操作：同时取两份样：操作：同时取两份样： + + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。样液中其它酸性物质。 + + 百里酚酞百里酚酞+ + 中性甲醛中性甲醛+ NaOH + NaOH 滴，中和了滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。和。 二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量（二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，原理：氨基酸在一定条件下

18、与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。生成蓝紫色化合物，可比色定量。二个别氨基酸的定量测定二个别氨基酸的定量测定介绍了介绍了8 8种氨基酸的定量测定方法。种氨基酸的定量测定方法。第七节第七节 氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（薄层层析法（一薄层色谱法（薄层层析法（TLC TLC 法）法）Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography简介：简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点

19、在薄层上，然后用合适上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。（一）原理：（一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附

20、、解吸、交换等组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不值，不同成分则有不同的同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。大致确定其含量。 R Rf f = a / b = a / bab样点样点溶剂前沿溶剂前沿点样原点点样原点优点：优点： 展开时间短，一般在展开时间短，一般在20302030分

21、钟，展开距离分钟，展开距离通常只需通常只需10 cm10 cm，且分离效果好。，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高1010010100倍）倍） 精确到精确到0.01ug0.01ug。 也可用于大量分离也可用于大量分离500 mg500 mg，作为样品制备，作为样品制备层析。层析。缺点：缺点：R Rf f值重现性比纸上层析差。值重现性比纸上层析差。分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。离子交换、凝胶等

22、。（三）操作方法：（三）操作方法： 薄层板制备薄层板制备 样品液制备样品液制备 点样：距薄板底端点样：距薄板底端2cm2cm处，用针画一标记作为处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔展开，点与点之间间隔1 12cm2cm。a.a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。意要等一个点干了再点另一个点。b.b.用一小直径用一小直径3 mm 3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。板子上先挖好一个小洞穴。 展

23、开：点样完了，放入密闭容器中（展开展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度槽），倾斜一定角度10103030，下端浸入展，下端浸入展开剂开剂1cm1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。顶端一部分，取出样板、晾干、显色。a.a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的展开剂的有关情况：主要是低沸点的2 23 3种有种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择吸附剂

24、的选择余地远远小于展开剂的选择。b.b.展开剂的选择方法：展开剂的选择方法：.微量圆环法。微量圆环法。.用小载波片试验，微量展开剂展开用小载波片试验，微量展开剂展开5cm5cm。.图解法：图解法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为：有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇

25、、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。c.c.展开的方式：展开的方式：上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多次展开。向多次展开。双向展开：双向展开： 显色：显色：a.a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。b.b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。c.c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）荧光指示剂加入到固体吸附剂中）定性：在

26、同一块板上，同等条件下操作，被测样定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同与标准样同时展开、显色，同 R Rf f 值即是；值即是； 查手册找相同的查手册找相同的 R Rf f 值。值。定量：定量：a.a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量样品斑点中含量ugug数。数。 b.b.斑点面积定量法。斑点面积定量法。 c. c.将样点取下来，定容，离心，比色。将样点取下来，定容，离心，比色。 d. d.利用薄层色谱扫描仪：利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津例：日本岛津 CS910 CS910 型双波长薄型双波长薄 层色谱扫描

27、仪层色谱扫描仪 介绍离心薄层色谱仪：介绍离心薄层色谱仪：1. LBG 1型离心薄层色谱仪型离心薄层色谱仪 北京产北京产2. 7924型离心薄层色谱仪型离心薄层色谱仪 美国美国Harrison 公司研制公司研制3. CLC 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达备量可达 10g 。二氨基酸自动分析仪法二氨基酸自动分析仪法三气相色谱法三气相色谱法四高效液相色谱法四高效液相色谱法10-3第十章的重点第十章的重点凯氏定氮法原理、分步、测定方法。凯氏定氮法原理、分步、测定方法。双缩脲法测定原理。双缩脲法测定原理。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。TLC法原理、方法，法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。值的作用及计算方法。47 结束语结束语