CHAPTER-12-酵母基因工程.ppt

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1、Chapter12 酵母基因工程酵母基因工程酵母：酵母： 单细胞真核微生物单细胞真核微生物繁殖方式：繁殖方式： 有性、无性生殖有性、无性生殖1996年，酿酒酵母年，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)完成完成全基因组的测序。全基因组的测序。酵母细胞结构图酵母细胞结构图第一节酵母基因工程的发展现状第一节酵母基因工程的发展现状l 酵母是真核生物，安全性高；酵母是真核生物，安全性高；l 酵母繁殖速度快；酵母繁殖速度快；l 采用高表达的启动子，可高效表达目的基采用高表达的启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控；因，而且可诱导调控；l 作为真核生物，提供翻译后加工和分泌的作为

2、真核生物，提供翻译后加工和分泌的环境，使产物与天然蛋白一样或类似。环境，使产物与天然蛋白一样或类似。一、酵母表达系统的优点一、酵母表达系统的优点l 酵母菌可将表达的外源蛋白与酵母菌可将表达的外源蛋白与N-末端前导肽融末端前导肽融合，指导新生肽分泌，在分泌的过程中可对表合，指导新生肽分泌，在分泌的过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰；达的蛋白进行糖基化修饰；l 不会形成不容性的包涵体，易于分离纯化；不会形成不容性的包涵体，易于分离纯化；l 可以移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物使可以移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物使用中引起免疫反应的问题；用中引起免疫反应的问题；l 酵母可进行蛋白的酵母可进行蛋

3、白的N-乙酰化、乙酰化、C-甲基化等，对甲基化等，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要作用。定向到膜的胞内表达蛋白具有重要作用。一、酵母表达系统的优点一、酵母表达系统的优点现有：酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯现有：酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、烷烃利用德毕赤酵母、多形汉逊酵母、烷烃利用型解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。型解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。主要应用于：主要应用于：J 改造酵母本身提高发酵性能改造酵母本身提高发酵性能J 利用酵母作为宿主表达异源蛋白利用酵母作为宿主表达异源蛋白二、酵母基因工程的发展现状二、酵母基因工程的发展现状(1)将将葡萄糖淀粉酶基因葡萄糖淀粉酶基因导

4、入酿酒酵母导入酿酒酵母酿酒酵母只能利用单糖、双糖和麦芽三糖，酿酒酵母只能利用单糖、双糖和麦芽三糖，而占麦芽汁总糖而占麦芽汁总糖25的多糖和糊精不能的多糖和糊精不能被利用，导致啤酒的高热量。被利用，导致啤酒的高热量。将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母中，可以将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母中，可以自身分泌葡萄糖淀粉酶，从而利用多糖和自身分泌葡萄糖淀粉酶，从而利用多糖和糊精。糊精。1.酿酒酵母的自身改酿酒酵母的自身改造造(2)将将外源的蛋白水解酶基因外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母导入酿酒酵母麦芽汁中残留的大分子蛋白质很容易影响啤麦芽汁中残留的大分子蛋白质很容易影响啤酒的胶体稳定性，而酿酒酵母的胞外蛋白

5、酒的胶体稳定性，而酿酒酵母的胞外蛋白质酶活力很弱，很难水解蛋白质。质酶活力很弱，很难水解蛋白质。将外源的蛋白质水解酶导入酿酒酵母基因组将外源的蛋白质水解酶导入酿酒酵母基因组中，利用自身分泌蛋白质水解酶可以降解中，利用自身分泌蛋白质水解酶可以降解一些大分子蛋白质。一些大分子蛋白质。1.酿酒酵母的自身改酿酒酵母的自身改造造(3)将将-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因导入酿酒酵母导入酿酒酵母大麦的大麦的-葡聚糖酶不耐热，在发芽和糖化过葡聚糖酶不耐热，在发芽和糖化过程中极易被破坏，同时啤酒中残留的程中极易被破坏，同时啤酒中残留的-葡聚糖易引起过滤困难，形成冷凝物、沉葡聚糖易引起过滤困难，形成冷凝物、沉淀物和胶

6、凝等问题。淀物和胶凝等问题。将将-葡聚糖酶基因导入酵母，可以有效降解葡聚糖酶基因导入酵母，可以有效降解麦芽汁中的麦芽汁中的-葡聚糖，改善啤酒的过滤葡聚糖，改善啤酒的过滤效率。效率。1.酿酒酵母的自身改酿酒酵母的自身改造造(4)将将ATP硫酸化酶硫酸化酶和和腺苷酰硫酸激酶基因腺苷酰硫酸激酶基因在在酿酒酵母体内表达，可以促进酿酒酵母体内表达，可以促进SO2的生成的生成，可以维持啤酒风味的稳定。，可以维持啤酒风味的稳定。(5)将将人血清清蛋白人血清清蛋白HAS基因基因转化到酿酒酵转化到酿酒酵母，可以生产富含母，可以生产富含HAS的啤酒新品种。的啤酒新品种。1.酿酒酵母的自身改酿酒酵母的自身改造造表达

7、水平表达水平：大多达到：大多达到1g/L，高达，高达10g/L。高效表达的实现高效表达的实现：开发高效启动子提高和控制外源基因的开发高效启动子提高和控制外源基因的转录水平转录水平(AOX1)；提高表达载体在细胞中的稳定性；提高表达载体在细胞中的稳定性； 通过多次同源重组以及通过多次同源重组以及rDNA介导的整合介导的整合方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。2.酵母表达系统表达异源蛋白酵母表达系统表达异源蛋白表达质量表达质量：异源蛋白由于过糖基化导致潜在：异源蛋白由于过糖基化导致潜在免疫性而不能医用，必须使表达的产物结免疫性而不能医用，必须使表达的产物结构与天然产

8、物一致。构与天然产物一致。提高表达质量提高表达质量：提高遗传稳定性，选用不同：提高遗传稳定性，选用不同的酵母宿主的酵母宿主2.酵母表达系统表达异源蛋白酵母表达系统表达异源蛋白1.解决酵母基因工程中存在的缺陷解决酵母基因工程中存在的缺陷外源蛋白形成聚合体、信号肽加工不完全以外源蛋白形成聚合体、信号肽加工不完全以及内部降解造成表达产物结构上有差异及内部降解造成表达产物结构上有差异2.应用于人类基因组计划应用于人类基因组计划3.利用酵母基因工程筛选更多的新药利用酵母基因工程筛选更多的新药4.改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本5.生理承受极限引起关注生理承受极限引

9、起关注三三.酵母基因工程的发展趋势酵母基因工程的发展趋势第二节第二节 酵母表达系统酵母表达系统1.酵母表达载体酵母表达载体(1)基本构架：基本构架：穿梭质粒穿梭质粒，原核部分原核部分: ori和抗生素抗性基因；和抗生素抗性基因；酵母部分酵母部分:在酵母中维持在酵母中维持复制的元件：复制的元件：如染色体自主复制序如染色体自主复制序列列ARS或整合型载体的整合介导区；或整合型载体的整合介导区；酵母转化子酵母转化子筛选组分筛选组分：主要是与宿主互补的营养：主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列或抗生素抗性基因；缺陷型基因序列或抗生素抗性基因；编码特定蛋白的基因编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列启动子

10、和终止子序列。一、酵母表达系统概述一、酵母表达系统概述(2)载体的复制形式载体的复制形式附加型载体附加型载体特点：拷贝数量大，传代中易丢失，影响重组菌的特点：拷贝数量大，传代中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。稳定性和表达量。代表：代表：2m质粒和利用质粒和利用ARS的载体的载体整合型载体整合型载体特点：与酵母细胞染色体基因组特点：与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定整合，稳定性高，但拷贝数低。性高，但拷贝数低。必须在酵母细胞内找到拷贝数很高的靶位点，位于必须在酵母细胞内找到拷贝数很高的靶位点，位于第七号染色体上的第七号染色体上的rDNA单元，是单元，是100200个拷贝的串联重复序列。个

11、拷贝的串联重复序列。1.酵母表达载体酵母表达载体pPIC9k质粒图谱质粒图谱l AOX-醇氧化酶醇氧化酶 l S - 分泌信号分泌信号l MCS 多克隆位点多克隆位点l TT-终止信号终止信号l HIS4-组氨醇脱氢酶组氨醇脱氢酶l Kanamycin-抗卡拉霉素抗卡拉霉素基因基因l pBR322-大肠杆菌的复大肠杆菌的复制起始位点制起始位点l Ampicillin-抗氨苄青霉抗氨苄青霉素基因素基因安全无毒，不致病安全无毒，不致病遗传背景清楚，容易进行遗传操作遗传背景清楚，容易进行遗传操作构建的载体构建的载体DNA容易进入，转化效率容易进入，转化效率较高较高发酵周期短，培养条件简单，容易进发酵

12、周期短，培养条件简单，容易进行高密度发酵行高密度发酵蛋白质分泌能力良好蛋白质分泌能力良好有类似高等真核生物的蛋白质翻译后有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能的修饰功能2.宿主宿主原生质体法原生质体法离子溶液法离子溶液法(Cs+、Li+)PEG1000法法电穿孔法和粒子轰击法电穿孔法和粒子轰击法3.酵母的酵母的DNA转化方转化方法法酿酒酵母酿酒酵母：过度糖基化：过度糖基化(40个甘露糖残基个甘露糖残基)巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母：8-14个甘露糖残基，个甘露糖残基，分分泌的糖蛋白的聚糖末端不含泌的糖蛋白的聚糖末端不含1,3-连接的连接的甘露糖残基甘露糖残基。解脂耶氏酵母解脂耶氏酵母：8-

13、10个甘露糖残基个甘露糖残基4.酵母分泌外源蛋白的糖基化酵母分泌外源蛋白的糖基化1.酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统附加型载体附加型载体：原核部分包括原核部分包括pUC质粒的复制起点和质粒的复制起点和amp+筛选筛选标记；真核部分包括酵母菌的标记；真核部分包括酵母菌的2m质粒的复制质粒的复制区和营养缺陷型相关基因。区和营养缺陷型相关基因。 启动子常用乙醇脱氢酶启动子启动子常用乙醇脱氢酶启动子PADH1，半乳，半乳糖诱导型启动子糖诱导型启动子PGAL，分泌信号为自身，分泌信号为自身-交交配因子，终止子用配因子，终止子用CYC1基因的转录终止子。基因的转录终止子。二、常用酵母表达系统二、常用酵母表

14、达系统没有在酵母中复制的质粒复制区，而是利用同没有在酵母中复制的质粒复制区，而是利用同源重组将载体整合到染色体上。源重组将载体整合到染色体上。特点是稳定性高，但拷贝数低。包括用于酵母特点是稳定性高，但拷贝数低。包括用于酵母转化的选择元件和原核部分的复制起点及筛选转化的选择元件和原核部分的复制起点及筛选标记。标记。启动子：主要是酿酒酵母自身的高效表达基因启动子：主要是酿酒酵母自身的高效表达基因启动子半乳糖启动子启动子半乳糖启动子PGAL1；信号肽：与酵母信号肽：与酵母-交配因子的前导序列融合，交配因子的前导序列融合，该引导序列可被该引导序列可被Kex2酶切除。酶切除。整合型载体整合型载体用酵母转

15、座子以产生多个插入拷贝用酵母转座子以产生多个插入拷贝通过通过rDNA介导的重组插入到核糖体介导的重组插入到核糖体DNA簇中，在宿主的染色体上以约簇中，在宿主的染色体上以约150个串联重复序列存在。个串联重复序列存在。酿酒酵母表达系统的不足之处：酿酒酵母表达系统的不足之处：较难进行高密度发酵较难进行高密度发酵蛋白质的分泌能力较差蛋白质的分泌能力较差两种方式提高拷贝数两种方式提高拷贝数甲醇营养型酵母是能在以甲醇为唯一碳源和能源甲醇营养型酵母是能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的酵母，包括假丝酵母、汉逊的培养基上生长的酵母，包括假丝酵母、汉逊酵母、毕赤酵母和球拟酵母酵母、毕赤酵母和球拟酵母与酿

16、酒酵母相比，甲醇酵母表达系统具有：与酿酒酵母相比，甲醇酵母表达系统具有：启动子强，受甲醇严格诱导，因此可调控外源启动子强，受甲醇严格诱导，因此可调控外源蛋白的表达；蛋白的表达； 能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化更接近高等真核生物；修饰，糖基化更接近高等真核生物；2.巴斯德毕赤酵母表达系巴斯德毕赤酵母表达系统统甲醇酵母在转化、基因替换、基因敲除等基甲醇酵母在转化、基因替换、基因敲除等基因操作上与酿酒酵母相似，简单易行，但外因操作上与酿酒酵母相似，简单易行，但外源蛋白的表达量更高，比酿酒酵母增加源蛋白的表达量更高，比酿酒酵母增加10-10

17、0倍；倍；重组菌的遗传性稳定，表达量和分泌效率高重组菌的遗传性稳定，表达量和分泌效率高，适合大规模发酵，适合大规模发酵能在无机盐培养基中快速生长，易进行工业能在无机盐培养基中快速生长，易进行工业化生产，高密度培养干细胞量可达化生产，高密度培养干细胞量可达100g/L以以上。上。甲醇营养型酵母表达系甲醇营养型酵母表达系统统以甲醇为唯一碳源和能源，诱导合成乙醇氧化以甲醇为唯一碳源和能源，诱导合成乙醇氧化酶酶(alcohol oxidase,AOX), AOX由由AOX1和和AOX2两个基因编码，约占可溶性蛋白的两个基因编码，约占可溶性蛋白的30以上，基因表达严格受甲醇的诱导和调控。以上，基因表达严

18、格受甲醇的诱导和调控。甘油和葡萄糖则抑制甘油和葡萄糖则抑制AOX的产生。因此巴斯德的产生。因此巴斯德毕赤酵母的表达载体大多是利用毕赤酵母的表达载体大多是利用AOX1启动子启动子的强诱导性使它下游的外源基因易于调控，并的强诱导性使它下游的外源基因易于调控，并具有很高的表达量。具有很高的表达量。载体主要有：载体主要有：pPIC9K,pHILD2,pHILS1,pPICZ.巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统无稳定的附加型载体质粒；无稳定的附加型载体质粒；整合型质粒整合型质粒：整合位点一般位于：整合位点一般位于组氨酸脱氢酶组氨酸脱氢酶HIS4或者或者AOX1区。区。典型载体包括：典型载体包括

19、：乙醇氧化酶基因乙醇氧化酶基因5AOX1启动子，启动子，3AOX1终终止子，多克隆位点，以止子，多克隆位点，以HIS4基因作为互补选基因作为互补选择标记或抗择标记或抗Zeocin(吉欧霉素吉欧霉素)作为筛选标记。作为筛选标记。 另包括另包括pBR322质粒的复制区和质粒的复制区和amp+抗性基因抗性基因(1)巴斯德毕赤酵母表达载体巴斯德毕赤酵母表达载体启动子：启动子：PAOX1，PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启三磷酸甘油醛脱氢酶启动子动子)l选择标记：为对应于营养缺陷型受体的野生型选择标记：为对应于营养缺陷型受体的野生型基因，常用基因，常用HIS4，抗性选择标记一般为，抗性选择标记一般为G418

20、(氨基糖苷类抗生素，氨基糖苷类抗生素，Kan抗性基因能对抗性基因能对抗抗G418对酵母的毒性对酵母的毒性)和和Zeocin抗性基因。抗性基因。l信号肽序列：由信号肽序列：由89个氨基酸组成的酿酒酵母个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号的分泌信号交配因子引导序列交配因子引导序列引导外源蛋引导外源蛋白的分泌。白的分泌。巴斯德毕赤酵母载体组成部分巴斯德毕赤酵母载体组成部分毕赤酵母整合型分泌表达载体毕赤酵母整合型分泌表达载体pPIC9K表达菌株：常用表达菌株：常用GS115和和KM71菌株，均为菌株，均为HIS4突变型。突变型。为了增加分泌蛋白的稳定性，避免被宿主蛋为了增加分泌蛋白的稳定性，避免被宿主蛋白

21、酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(pep4), SMD1165(prb1), SMD1163(pep4, prb1), pep4和和prb1分别分别表示编码蛋白酶表示编码蛋白酶A和蛋白酶和蛋白酶B的基因缺陷型。的基因缺陷型。(2)巴斯德毕赤酵母表达菌株巴斯德毕赤酵母表达菌株选择过程选择过程G418：是一种氨基糖苷类抗生素，：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性基因能对抗抗性基因能对抗G418对酵母对酵母的毒性。的毒性。导入质粒导入质粒筛选筛选HIS4缺陷培养基缺陷培养基G418酵母培养基酵母培养基低浓度低浓度高浓度高浓度原生质体法原

22、生质体法电激法电激法PEG法法LiCl法法(3)转化方法转化方法当整合载体转化受体菌时有三种整合方式当整合载体转化受体菌时有三种整合方式5AOX1和和3AOX1能与染色体发生同源重组能与染色体发生同源重组，使染色体带有一个拷贝的外源基因；，使染色体带有一个拷贝的外源基因；染色体染色体AOX1区与载体质粒的区与载体质粒的AOX1发生单位发生单位点互换；点互换；染色体染色体HIS4基因与载体基因与载体HIS4基因发生置换。基因发生置换。 HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主恢复的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主恢复野生型

23、，野生型，HIS4区和区和AOX1区位点的整合都使区位点的整合都使转化子具有转化子具有HIS4基因，可利用表型差异筛选基因，可利用表型差异筛选。(4)整合方式整合方式原生质体法转化使细胞群中产生多拷贝转化原生质体法转化使细胞群中产生多拷贝转化子效率比较高，若通过子效率比较高，若通过G418抗性水平筛选高抗性水平筛选高拷贝，则配合电激法转化效果较好拷贝，则配合电激法转化效果较好体外在载体上多次插入目的基因片段体外在载体上多次插入目的基因片段将载体中目的基因两端连接上来自宿主将载体中目的基因两端连接上来自宿主rDNA或其他非必需高重复的基因片段，通过同源或其他非必需高重复的基因片段，通过同源重组而

24、达到高拷贝整合的目的重组而达到高拷贝整合的目的用基因的功能筛选高拷贝整合，高拷贝整合用基因的功能筛选高拷贝整合，高拷贝整合提高基因的表达量，直接通过表达量的差异提高基因的表达量，直接通过表达量的差异进行筛选进行筛选(5)获得高拷贝数整合转化子的方获得高拷贝数整合转化子的方法法外源基因中外源基因中A、T含量高容易提前终止表达含量高容易提前终止表达密码子是否符合甲醇酵母的偏好性，密码子是否符合甲醇酵母的偏好性，61个密个密码子中码子中25个是酵母所偏爱的，对偏好密码子个是酵母所偏爱的，对偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比的使用程度和基因表达水平成正比mRNA5非翻译区的核苷酸序列和长度会影非

25、翻译区的核苷酸序列和长度会影响到核糖体响到核糖体40S亚单位对亚单位对mRNA的识别的识别选取合适的宿主菌选取合适的宿主菌产物自身的稳定性产物自身的稳定性液体深层发酵时的培养条件是否合适液体深层发酵时的培养条件是否合适(6)提高外源基因表达的注意事项提高外源基因表达的注意事项分子生物学研究基础差，对其进行遗传分子生物学研究基础差，对其进行遗传改造困难较大；改造困难较大；不是一种食品微生物，发酵时需要添加不是一种食品微生物，发酵时需要添加甲醇，用它来生产药品或食品还没有被甲醇，用它来生产药品或食品还没有被广泛接受；广泛接受；密度虽较高，但发酵周期较长。密度虽较高，但发酵周期较长。甲醇酵母表达系统

26、的缺点甲醇酵母表达系统的缺点Invitrogen：For High-level and Large-scale Expression and Secretion of Bioactive Recombinant Proteins in Pichia pastoris3. PichiaPink Expression System1. Easy selection of expression clones using ADE2 complementation (i.e.,complementation of adenine auxotrophy腺嘌腺嘌呤互补呤互补) rather than ant

27、ibiotic resistance.The PichiaPink System offers the following advantages over existing Pichia pastorisbased protein expression systems:2.Essentially all transformants in the PichiaPink system express the protein of interest.3.Three protease knockout PichiaPink strains to help reduce the impact of pr

28、oteases and the need for heavy protease inhibitor use during expression, as well as a “protease wild-type” strain.4.ADE2 complementation ensures higher stability of transformants during scale-up of protein expression.Advantages of the PichiaPink5. Choice between the pPink-HC vector containing Saccha

29、romyces cerevisiae-mating factor pre-sequence for high-copy number secreted protein expression or the pPink-HC and pPink-LC vectors (for high- and low-copy number expression, respectively) and eight secretion signal sequences for optimization of secreted protein expression.Advantages of the PichiaPi

30、nk6.Optional intracellular protein expression using the pPink-HC and pPink-LC vectors by omitting(省略省略) the secretion signal sequences at the cloning step.7. Simpler media growth conditions for screening and convenient PichiaPink media pouches.Advantages of the PichiaPink(1) vectors(1) vectorspPink-

31、HC or LC vector and cloning(1) vectorspPink-HC vector and cloningThe strains in the PichiaPink kits are ade2 auxotrophs that are unable to grow in the absence of adenine due to the full deletion of the ADE2 gene and part of its promoter. The expression plasmids included in the kit contain the ADE2 g

32、ene (under its own promoter) as the selection marker. Selection markerTransformation of the PichiaPink strains with the expression plasmids enable the strain to grow again on medium lacking adenine (Ade dropout medium or minimal medium).Further, the color of the transformant colonies indirectly indi

33、cates the relative expression levels of your protein of interest.Selection markerPichiaPink Strain 1 is the wild-type ade2 knockout Pichia strain. The ade2 knockout renders the PichiaPink strain an adenine auxotroph (i.e., it requires an external adenine source for growth). These cells are unable to

34、 grow on minimal medium or adenine dropout medium, and display a slow-growth phenotype on rich medium.(2)Genotypes of PichiaPink StrainsThe PichiaPink Strain 2 is a pep4 knockout, which prevents it from synthesizing proteinase A, a vacuolar aspartyl (天冬氨酰天冬氨酰) protease capable of self-activation. Si

35、nce proteinase A also plays a role in the subsequent activation of additional vacuolar proteases, pep4 knockout strains have a diminished proteinase B activity and lack carboxypeptidase Y activity altogether.(2)Genotypes of PichiaPink StrainsPichiaPink Strain 3 is a prb1 knockout, which prevents it

36、from synthesizing proteinase B, a vacuolar serine protease of the subtilisin(枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶) family.PichiaPink Strain 4 is double knock-out for both proteinases A and B (i.e., pep4 and prb1), therefore has the lowest protease activity amongst the PichiaPink strains.(2)Genotypes of PichiaPink Strains

37、We recommend electroporation or chemical methods for transforming PichiaPink Strains with PichiaPink vectors. 1.Electroporation yields 103 to 104 transformants per g of linearized DNA and does not destroy the cell wall of Pichia.(3) Method of Transformation2. In contrast with Pichia systems that rel

38、y on antibiotic resistance markers for selection, you may also use spheroplasting(原生质原生质) for transforming PichiaPink Strains.Spheroplasting involves removal of the cell wall to allow DNA to enter the cell.When antibiotic resistance markers are used, cells must first regenerate the cell wall before

39、they are able to express the resistance gene. PichiaPink transformants, on the other hand, are selected using nutritional markers.(3) Method of TransformationThe growth temperature of PichiaPink strains is 2430 for liquid cultures, plates, and slants. Growth above 32 during induction can be detrimen

40、tal to protein expression and can even lead to cell death. (4) Growth of PichiaPink StrainsOther important facts:Doubling time of log phase untransformed PichiaPink strains (i.e., ade2) in YPD is 6 to 8 hours. Untransformed prb1 PichiaPink strains (i.e., PichiaPink Strains 3 and 4) grow slightly slo

41、wer than PichiaPink strains expressing functional PRB1 gene product.(4) Growth of PichiaPink StrainsDoubling time of log phase transformed PichiaPink strains (i.e., expressing ADE2 gene product) in BMGY is 4 hours.Doubling time of log phase transformed PichiaPink strains in BMMY is 16 hours.One OD60

42、0 = 5107 cells/mlNote: Growth characteristics of PichiaPink strains may vary depending on the recombinant protein expressed.(4) Growth of PichiaPink StrainsWhen using plates or medium containing methanol as growth medium, we should add methanol every day to compensate for loss because of evaporation

43、 or consumption.For plates add 100 l of 100% methanol to the lid of the inverted plate.For liquid medium add 100% methanol to a final concentration of 0.5%.(5) Growth on Methanol(6)ExperimentalProcess(6)ExperimentalProcess作业及思考题作业及思考题1.叙述酵母附加型载体和整合型载体用在叙述酵母附加型载体和整合型载体用在表达外源基因上的区别。表达外源基因上的区别。2.如何通过提高基因在染色体上的拷贝数如何通过提高基因在染色体上的拷贝数来提高外源基因的表达？来提高外源基因的表达？3.设计一个实验来构建高产木聚糖酶的工设计一个实验来构建高产木聚糖酶的工程菌。程菌。结束结束