最新外周血DNA的提取PPT课件.ppt

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1、外周血外周血DNA的提取的提取实验目的实验目的v 掌握人全血掌握人全血DNA提取的原理和操作步骤。提取的原理和操作步骤。v 了解了解DNA基本理化性质。基本理化性质。v3. 初步了解初步了解DNA琼脂糖电泳鉴定的方法。琼脂糖电泳鉴定的方法。实验步骤实验步骤 1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL, 按照1:51:10的比例加入去离子水裂解8min，然后1700rpm/min离心，去掉含有红细胞碎片的上清液，重复裂解一次，留取白细胞沉淀。实验步骤实验步骤DNA细胞裂解液(pH 8.0)：150mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、0.5%SD

2、S DNA细胞裂解液中SDS的是表面活性剂，主要作用裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面。另外，Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相，减少在蛋白质层的滞留。2.加入0.5mL的DNA细胞裂解液来悬浮白细胞沉淀。实验步骤实验步骤3. 悬浮后的溶液中添加蛋白酶K 20L，65水浴0.5h，期间轻缓地倒转几次。 4. 室温下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液，剧烈地震荡混合10min，然后8000rpm/min离心10分钟，然后将水相移至新的离心管中。细胞膜裂解以后，细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中，而蛋白酶K 具有水解蛋白质和DNA酶的作用

3、，并且在EDTA和SDS存在的条件下仍保持较高的活性。在苯酚/氯仿加入少量的异戊醇，可以减少实验中气泡的产生，而且有利于分层，保持分层的稳定性。实验步骤实验步骤5. 添加1mL的预冷的无水乙醇到水相中，混匀，8000rpm/min离心3分钟。加入无水乙醇可以吸收水相中的水分，使得DNA沉淀析出。6. 沉淀用70%的预冷乙醇洗涤两次，然后干燥，最后用50L去离子水悬浮。70%的冰乙醇可以去除可溶性的多糖、金属离子等杂质以及残留的苯酚/氯仿等。实验步骤实验步骤7. 用1%的琼脂糖电泳鉴定所提取的DNA。8. 剩余的DNA贮存在4冰箱中,备用。注意事项注意事项一. 提取染色体DNA最根本的要求就是保持核酸的完整性。所以操作过程中要注意：1 物理因素 高分子量的DNA长而弯曲，仅有极微的侧向稳定性，机械张力和高温很容易使DNA分子发生断裂。因此，实际操作过程中尽量轻缓，尽量避免过度的溶液吹打转移，以及过高的温度。2 化学因素 在过酸的条件下，由于DNA脱嘌呤而导致DNA的不稳定，容易在碱基脱落的地方发生断裂。因此避免使用过酸的条件。二. 步骤3转移水相时，此时的水相可能比较粘稠，必须非常的小心将水相吸入新离心管并防止搅动和吸入分层界面的杂质蛋白。三. 在提取过程中，使用离心管及枪头都应该是干净无菌的，相应试剂配制及保存要规范。谢谢！谢谢！16 结束语结束语