2022年阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展 .pdf

《2022年阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展 .pdf（5页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、收稿日期: 2005210231作者简介:顾觉奋,女,生于1933年,教授,主要从事微生物制药教学与研究。文章编号: 1001 - 8751 (2006) 03 - 0122 - 04阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展顾觉奋 陈 菁(中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009 )摘要:阿卡波糖是治疗型糖尿病的一线药物。其在游动放线菌SE50中的生物合成过程是在由Acb基因群编码的一系列酶的催化作用下完成的,包括氨基环醇的生成, 42 氨基 24, 62 二脱氧葡萄糖的合成和之后的糖基化作用生成阿卡波糖 。以游动放线菌作为阿卡波糖的产生菌时可以通过控制培养液中麦芽糖的浓度和发酵液的渗透压来

2、提高阿卡波糖的产量。组分C是在发酵的后期由阿卡波糖直接转化而来的,给下游的分离纯化造成了困难,如在发酵液中添加微量的阿卡波糖类似物抑制剂可转化这一反应,其中Valiena m ine显示了最大的抑制作用。关键词:阿卡波糖; 生物合成;组分C;游动放线菌; 渗透压中图分类号:Q255 文献标识码:A阿卡波糖从游放线菌(Actinoplanessp. SE50)的发酵液中提取而来,自 1990年上市后在许多国家被用于 型糖尿病的治疗,控制病人在进食含有淀粉的食物后的血糖含量。阿卡波糖对肠道内的蔗糖酶 、 麦芽糖酶 、 糊精酶和葡萄糖淀粉酶都有强烈的抑制作用 ,并对2 淀粉酶有微弱的抑制作用,还具有

3、良好的药动学性质和低毒性,使其成为理想的药物。游动放线菌的培养液中还含有一系列的阿卡波糖类似物 (图 1) ,其中组分C的结构与阿卡波糖极为相似造成了下游分离纯化的困难。图1 从游动放线菌的培养基中提取的阿卡波糖及类似物1阿卡波糖的生物合成研究进展1 . 1 与生物合成相关的基因Acb基因群编码一系列和阿卡波糖生物合成及转运相关的酶。按其编码的酶的功能可分为三大类 :生物合成基因acbAB和acb VUSRPIJKMLNOC,转运基因acb WXY和acbFGH,细胞外与2 葡萄糖苷和阿卡波糖代谢相关的基因acbD、acbE和acbZ 1。1 . 2 可能的生物合成途径从阿卡波糖的发现至今科研

4、人员一直在探索其生物合成途径,以期为阿卡波糖的生产提供理论基础 。本文将阐述最新提出的阿卡波糖在游动放线菌SE50中可能的生物合成途径 1 (图 2)并详细介绍近 2年的最新研究发现。阿卡波糖由氨基环醇、 42氨基 2 4, 62 二脱氧葡萄糖和一分子麦芽糖三部分组成 。1 . 2. 1氨基环醇的生成 22epi2 52 epi2valiolone磷酸化生成22epi252epi2valiolone272phosphate 2 。C27位的磷酸化可被看作是一种自我保护机制 3 。有试验证明,当阿卡波糖的氨基环醇C2 7位被磷酸化后 ,就不再对细胞质中对阿卡波糖敏感的麦芽糖酶显示抑制作用。在阿卡

5、波糖的合成过程中会生成多种含有C2 7环醇和acarviosyl的物质 ,他们对细胞质中的许多水解酶(如 2 葡萄糖苷酶和葡甘露聚糖酶 )有抑制作用 。这样在合成的一开始将C27位磷酸化就可以阻止这种抑制作用,以保证细胞对各种糖源的利用 ;22epi2 52epi2valiolone2 72 phosphate 在 AcbO编码的差向异构酶的催化作用下生?221?国外医药抗生素分册2006年5月第27卷第3期名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - -

6、- - - - - - - 图2阿卡波糖的生物合成途径成 52 epi2 valiolone272phosphate,这一产物已通过质谱和核磁共振验证。值得一提的是催化这一反应的酶AcbO不需要任何的辅因子,而且与任何已知的差向异构酶都没有相似性,所以它很可能代表了一类全新的差向异构酶 4; 2003年有试验数据表明52epi2valiolone2 72 phosphate在 AcbL 编码的NADP依赖的脱氢酶催化下生成52epi2valiolol2 72 phosphate; 52epi2valiolol2 72 phosphate在 AcbN 编码的脱水酶的催化下生成12 epi2 va

7、lienol2 72 phosphate,这一步到目前为止还只是推论。最近又在游动放线菌中发现了一种新的激酶(72 kinase) ,可以将12 epi2 valienol磷酸化为 12 epi2 valienol2 72 phosphate,而且对valienol也有弱磷酸化作用,但对其他的C27环醇几乎没有磷酸化作用 。研究发现这种12 epi2valienol2 72kinase很可能与 12 epi2 valienol的补救途径有关。如图3所示 , 12epi2valienol既可能是阿卡波糖合成途径中的副产图312epi2valienol和valienol被重新引入阿卡波糖的生物合成

8、过程物也可能是阿卡波糖被菌体重新吸收的未被磷酸化的降解产物,然后被72kinase磷酸化生成12epi2 va2?321?阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展顾觉奋等名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - lienol2 72 phosphate,这样12epi2 valienol就被重新引入到阿卡波糖的生物合成途径中来。此外12 epi2va2lienol的差向异构体valienol也有可能被重新引入阿卡波糖的合成途径中

9、。由于cos midpHTWCos6 (包含所有的 ACB 基因 )没有显示任何的12epi2valienol2 72kinase活性 ,所以编码这一激酶的基因不属于ACB基因群 5; 12epi2valienol2 72 phosphate在 C2 1被磷酸化 ,生成1, 72diphospho2 12epi2valienol但是催化这一步反应的酶至今还没有被确认; 1, 72 diphospho212epi2valienol核 苷 酸 化 生 成NDP212epi2valienol272phosphate。催化这一反应的酶已被确认是由acbR编码的GlgC(一种 ADP2 葡萄糖合成酶)。

10、1. 2. 242 氨基 2 4, 62 二脱氧葡萄糖的合成D2 12磷酸葡萄糖(D2glucose 2 12 phosphate)核苷酸化为dT2DP2D2 葡萄糖 ,由 dTDP2 葡萄糖合成酶(AcbA )催化 ; dTDP2D2 葡 萄 糖 由dTDP2 葡 萄 糖 2 4, 62 脱 水 酶(AcbB)催化生成dTDP242 酮 262 脱氧 2 葡萄糖;dT2DP242 酮 262 脱氧 2 葡萄糖在acbV编码的氨基转移酶的催化下生成dTDP 242 氨基 2 4, 62 双脱氧葡萄糖。有趣的是这一氨基转移酶与初级代谢中的氨基转移酶相关而不属于与抗生素和其他次级代谢产物合成相关的

11、S MATS 家 族(次 级 代 谢 产 物 的 氨 基 转 移酶 ) 3 。1. 2. 3阿卡波糖的合成dTDP242 氨 基 24, 62 脱氧 2 葡 萄糖 6 和 NDP212epi2 valienol2 72 phosphate在转糖基作用下生成dTDP2 acarviose2 72 phosphate,催化这一步反应的酶可能由acbI和acbS编码 。目前研究认为细胞质中的合成过程基本到此为止,但dTDP2acarviose2 72 phosphate也可能再连接上1个或2个单糖基 ; 细胞质中合成的终产物(含有不同数量糖基的 dTDP2 acarviose2 72 phospha

12、te)由转运蛋白(Acb WXY编码 )转移至细胞外,麦芽糖分子直接整合进dTDP2acarviose2 72 phosphate,合 成 了 阿 卡 波 糖 ,这 一 步 由acbD 7编码的arviosyl转移酶催化。事实上 , dTDP2acarviose2 72 phosphate也可能连接更多的糖基,所以最终形成的是包括阿卡波糖和组分C在内的抑淀粉酶素复合物(amylostain complex) 。2阿卡波糖发酵工艺的研究进展阿卡波糖游动放线菌的优化菌株通过多阶段分批发酵而来。发酵液中组分C是在发酵过程后期由阿卡波糖自身转化而成的衍生物。由于二者的分子结构非常相似所以发酵液中组分C

13、的存在为阿卡波糖的纯化带来了很大困难。因此 ,近 2年来 ,人们寻求新的措施来提高阿卡波糖的产率并同时减少阿卡波糖向组分C的转化 。2. 1 严格控制发酵液中葡萄糖和麦芽糖的浓度试验发现麦芽糖与葡萄糖是最好的混合碳源。在研究以游动放线菌的变种游动放线菌CKD 2 485216为阿卡波糖产生菌种的过程,建立了底物、 产物和菌体生长的曲线图 8 (图 4) 。从图 4可见 ,在发酵早期就有阿卡波糖的形成,其浓度随着菌体的生长而升高 ,在发酵末期,副产物组分C开始积累 。葡萄糖和麦芽糖既是能源物质又是阿卡波糖的前体物质 。葡萄糖在发酵早期就被消耗尽,而麦芽糖在整个发酵过程中缓慢地被利用,并在葡萄糖耗

14、尽之后,充当能源物质。因为麦芽糖会直接掺入阿卡波糖的结构中 ,所以葡萄糖在早期的消耗会导致后期麦芽糖含量的减少,进而影响了阿卡波糖的产量。因此必须严格控制葡萄糖的含量并保持麦芽糖在发酵液中的高浓度来提高阿卡波糖的合成。有关资料报道 ,葡萄糖和麦芽糖最适合的浓度分别为510g/L和 100120g/L 。()阿卡波糖; ()组分C; ()麦芽糖; ()葡萄糖图4 阿卡波糖发酵过程中底物消耗和产物生产曲线2. 2 发酵液渗透压对阿卡波糖合成的影响在通常的发酵过程中培养液的渗透压并不是一个十分重要的因素。但是在阿卡波糖的发酵过程中 ,渗透压对其产量有着决定性的作用。可能是由于阿卡波糖的生物合成过程中

15、麦芽糖直接掺入阿卡波糖的分子中,提高培养液的渗透压,将会促进麦芽糖向细胞内的运输,从而提高阿卡波糖收率。据美 国2000年 专 利 报 道 9 , 以 游 动 放 线 菌SE50/10为发酵菌,阿卡波糖的合成与培养液的渗透压有着密切的关系。最适宜的渗透压值为400mOs m /kg。当渗透压大于500 mOs m /kg或小于300mOs m /kg 时 ,阿卡波糖的产量都会下降,当渗透压大于 600 mOs m /kg或小于200 mOs m /kg时阿卡波糖?421?国外医药抗生素分册2006年5月第27卷第3期名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - -

16、- - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - 产量明显的下降,甚至没有阿卡波糖的生成。一般情况下低的渗透压不会对微生物的生长及代谢造成严重影响 ,但是在这里却严重影响了阿卡波糖的合成 。重要的是不同的生产菌有不同的最适渗透压,所以在实际生产中应探索具体菌株的最适渗透压值以期提高产量,例如以游动放线菌CKD 2 4852 16为阿卡波糖产生菌种时,阿卡波糖的合成与渗透压的关系就会发生变化(图 5) 。从图5中可见 ,从 100500mOs m /kg阿 卡 波 糖 的 浓 度 不 断 增 加,在500mO

17、s m /kg时达到最大值3200mg/mL。然而大于500mOs m /kg之后 ,其浓度开始降低,可能是由于高渗透压抑制了菌体的生长。图5 渗透压对阿卡波糖发酵产率的影响在发酵过程中一定要严格控制发酵液的渗透压 ,努力维持最适的渗透压以利于阿卡波糖的生产。影响发酵液渗透压的因素有: (1)培养液的组成(很多营养物质对发酵液的渗透压有影响) ; ( 2)发酵过程中对有渗透压活性物质的消耗; (3)发酵过程中有渗透压活性物质的释放。为了保持最适的渗透压可采取以下措施。 在发酵过程中逐渐少量地添加已经配置好的,有适当渗透压的培养基; 逐渐少量添加某一种或几种营养物质来调节发酵液的渗透压 ; 在发

18、酵过程中一边逐渐添加已经配置好的有适宜渗透压的培养基,一边不断的流出含有产物的发酵液 ,这样可以保持渗透压在一个合适的范围之内 。2. 3 用阿卡波糖的类似物抑制阿卡波糖向副产物组分C的转化副产物组分C是由阿卡波糖直接转化而来的,其化学结构与阿卡波糖十分相似,所以增加了纯化的难度 。催化这一反应的酶至今还没有被确认,但很可能是由发酵后期一些融解的细胞中释放出来的并与海藻糖的代谢相关。表1抑制剂valienam ine对阿卡波糖和组分C产量的影响发酵液渗透压mO s m /kg阿卡波糖无抑制剂valienamine组分C (mg/L )无抑制剂valienamine302L Jar2002530

19、2540340385003054332065045700243029308405615002L Pilot200265025903503750034503490680437002780321088052以游动放线菌CKD2485216为阿卡波糖产生菌的试验表明,渗透压为500mOs m /Kg时,阿卡波糖的产量达到最大值。在3种不同的渗透压情况下加入抑制剂Valienam ine都可以明显地降低组分C的产量,并同时增加了阿卡波糖的产量。在游动放线菌的发酵液中存在一系列的阿卡波糖类似物 ,由于与阿卡波糖的结构相似所以可以充当催化这一转化反应的酶的竞争性抑制剂,如有效霉胺 (Valienamine

20、) 、 validoxylamine A、 有效霉素( vali2damycin )和组分2。都显示了明显的抑制作用,其中有效霉胺的抑制作用最强 10。如表1所示 ,在以游动放线菌CKD2485216为阿卡波糖生产菌时,在30L和 1500L的发酵试验中加入抑制剂Valienamine都可以明显的降低组分C的产量 。由于抑制了阿卡波糖向组分C的转化 ,阿卡波糖的产量也就相应地提高了 。据报道如果在发酵早期加入微量(微摩尔数量级 )的 Valienamine可以使组分C的产量减少31% 92%。参考文献 1 W ehemeier UF, Piepersberg W. B iotechnol og

21、y and molecularof the2glucosidaseinhibit or acarbose J . Appl M icrobiolB iotechnol, 2004, 63: 613 2 Zhang CS, Stratmann A, B lock O, et al. B iosynthesis of the C( 7)2cyclitilmoiety of acarbose inActionplanessp.SE50 /110. 72O2posphorylati on of the initialcyclit ol precursor leadsto proposal of a n

22、ew biosynthetic pathway J. J B iol Chem,2002, 277 (25) : 22853 3 Piepersberg W , Diaz2Guardamino P M , Stratm ann A, et al.Recentdevelopmentinthe biosynthesisand regulation ofa m inoglycosides.In Fierro, F Martin,JF, ( eds) M icrobialSecondaryMetabolites:B iosynthesis, Genetics and RegulationIn Rese

23、arch Signpost: Kerala, 2002, pp1(下转第142页)?521?阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展顾觉奋等名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - crob Agents Chemother, 2005, 49 (11) : 4485 11 BennettP M.Integrons and gene cassettes: a genetic con2struction kit for bacte

24、ria J . Antim icrob Agents Chemother,1999, 43: 1 12 LeeK, Chong Y, Shin HB, et al. Modifiedhodge test andEDTA2disksynergytests toscreen metall o2 2lactamase2producing strains of Pseudo monas and Acinetobacter species J. Clin M icrobiol Infect, 2001, 7 (2) : 88 13 Houang ETS, Chu YW , Lo W S,et al. E

25、pidem iology ofri2famp in ADP2ribosyl transferase (arr22)and metall o2 2lac2tamase (blaIM P24) gene cassettes in classintegronsinAcinetobacter strains isolated from blood cultures in 1997 to2000 J . Antim icrob Agents Chemother, 2003, 47: 1382 14 Garau G, Garda2SiiezI, Bebrone C, et al. Update ofthe

26、standard numberingsche me for class B2lactamases J .Antim icrob Agents Chemother, 2004, 48: 2347 15 Lee K, Lee W G,Uh Y, et al. V I M2and I M P2type metall o2 2lactamase2producingPseudo monas s pp.and Acinetobacters pp. in Korean hospitals J . Emerg Infect D is, 2003, 9: 868 16 Yum JH, YiK, Lee H, e

27、t al. Molecularcharacterizati on ofmetall o2 2lactamase2producingAcinetobacter baumanniiandAcinetobacter geno m ospecies3 from Korea:identificati on oft wo new integrons carrying the blaVIM22gene cassettes J. JAntim icrob Chemother, 2002, 49: 837(上接第125页 ) 4 Zhang CS, Podesch wa M , A ltenbach HJ, e

28、t al. The acarbose2biosynthetic enzyme AcbO from Actionplanes s p. SE50 /110 isa 22epi252epi2valiolone272phosphate 22epimerase J . FEBSLett, 2003 (13) , 540: 47 5 Zhang CS, Podesch wa M ,W ehemeier UF, et al. Identificati onof a 12epi2valienol272kinase activityin the producer of acar2bose, Actionpla

29、ness p. SE50 /110 J. FEBS L ett, 2003 ( 13) , 540: 53 6 Slmeon GB, Taifo M , Floss HG, et al. B iosynthetic studies onthe2glucosidase inhibit or acarbose: the chem ical synthesisof dTDP242amino24, 62dideoxy2 2D2glucose J .Carbohy2drates, 2002, 337: 297 7He mkerM , Stratmann A, Goeke K, et al.Identif

30、icati on,clo2ning,expression and characterizati on ofthe extracellulara2carbose modifyingglcosyltransferase,AcbD,from Action2planes s p. SE50 J. J Bacteriol, 2001, 183: 4484 8 Byoung TC, Chul SS . Reduced formation of byproduct compo2nentCinacarbosefermentati onbyActi onp lanessp.CKD485216 J. Biotec

31、hnol Prog, 2003, 19: 1677 9 BeuninkJ, Schedel M , Steiner U. O s moticallycontrolled fer2mentati on p rocessforthe preparation ofacarbose P .US6130072, 2000210210 10 M ahmud T, Tornus I, Engelkrout E, et al. B iosynthetic stud2ies on the2glucosidase inhibit or acarbose in Actionplanessp: 22epi252epi2valionlone is the direct precursor of the va2lienam ine moiety J . J Am Chen Soc, 1999, 121: 6973?241?新发现的获得性金属2 内酰胺酶GIM21和SIM21曹敬荣名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - -