2022年培养基优化设计 .pdf

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1、1 课 程 设 计 说 明 书课程名称：新 编 生 物 工 艺 学设计题目 : 培养基优化设计院系：生物与食品工程学院学生姓名：学号：200806040035 专业班级：0 8生物技术指导教师：关现军2011 年6 月 3 日名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 12 页 - - - - - - - - - 2 课 程 设 计 任 务 书设计题目培养基优化设计学生姓名张学义所在院系生物院专业、年级、班08生物技术设计要求：1、进一步巩固加深所学生物工艺学 、 生

2、物工程设备、 生物工厂设计、 生物反应工程和发酵工艺学等专业课程的基本理论和知识，使之系统化、综合化。2、培养学生综合运用基础理论和专业知识解决工程实际问题的能力。3、掌握有关设计手册（如化工设备设计手册、 化学工程手册等）的使用。学生应完成的工作：优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆、牛肉膏、乳糖。研究结果表明，嗜酸乳杆菌、 嗜热链球菌、 保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌， 在优化后的培养基发酵液中，培养，菌落数均高于原培养基发酵液的菌落数，达到护以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约0，同时使菌种数量达到最大。参考文献阅读：【1】徐中儒 .农业试验最优

3、回归设计. 北京 :农业出版社,1988 【2】贵州农学院 . 生物统计附试验设计. 北京 :农业出版社,1983 【3】刘忠敏，林兴兵，杨生玉. 现代应用生物技术. 北京：化学工业出版社，2004 【4】陶兴元，刘志国，田俊. 生物工程概论 . 北京：化学工业出版社，2005 【5】诸葛健，沈微 . 工业微生物育种. 北京：化学工业出版社，2006 【6】鲍新华 . 生物工程 . 北京：化学工业出版社，2008 工作计划：用开始两周的时间进行课程设计的实验，包括实验设计、实验准备、实验实施、实验结果的记录、实验的后续补充。实验全部完成后，进行课程设计的撰写，讨论实验结果，提出问题、解决问题、

4、得出结论与探索的新方向，完成本次课程设计。任务下达日期：2011 年5 月23 日任务完成日期：2011 年6 月3 日指导教师（签名） ：学生（签名）： 张学义名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 12 页 - - - - - - - - - 3 目录1. 摘要 页码2. 关键字 页码3. 设计背景 页码 3.1培养基简介 页码3.2 培养基优化设计的重用意义 页码4 设计方案 页码 4.1原材料制备 页码 4.2菌种的选择 页码 4.3营养因子的比例设 页码

5、4.4 理化条件控制 页码 4.5总工艺流程列叙 页码5 预期结果 页码6 方案实施时可能出现的问题与对策 页码7 设计感受 页码7.1 关于本方案 页码 7.2 关于自我 页码8 参考文献 页码. 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 12 页 - - - - - - - - - 4 1 摘要以改良发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋白陈等 个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化。利用8（的 7 次方）正交实验，优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉

6、米浆、牛肉膏、乳糖。研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的培养基发酵液中， 培养 ，菌落数均高于原培养基发酵液的菌落数， 达到 护以上， 乳酸菌发酵液得到了浓缩， 大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约0，同时使菌种数量达到最大。2 关键字乳酸菌，营养因子，优化培养，最大产菌 3. 设计背景3.1 乳酸菌培养基简介乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要意义。设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌种的适应期，利于增值。乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂, 影响生长的因素多 , 在实际工作中还应

7、做其他条件的优化 , 如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等 , 因工作量大而时间有限 , 只能对配方作初步的优化设计。为了降低生产成本, 在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解 , 用以提高增菌效果 , 再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物, 在发酵罐内完成乳酸菌的增菌 , 罐内可以通入过滤除菌的N2和 CO2 , 以降低反应液氧化还原电势( 特别是保加利亚乳杆菌 ) 。若有自动化发酵罐还可通过监测pH值, 发酵罐自动注入灭菌的 1 mol - 1NaOH或 NH4OH 液, 以中和代谢乳酸。培养基（Medium ）是供微生物、 植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物

8、、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 12 页 - - - - - - - - - 5 培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在26的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，现在

9、均改制成粉末。化学分类：天然培养基 （指一类利用动、 植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、 麦芽汁培养基等） ；组合培养基 （又称为合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。） ；半组合培养基（指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。）物理分类：液体培养基（一类呈液态的培养基。 ） ； 固体培养基（一类外观呈固态的培养基。根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤膜。 ） ； 半固体培养基（指在液体培养基中加入

10、少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基。 ） ； 脱水培养基（ 又称预制干燥培养基，指含有除水分外的一切成分的商品培养基。 ) 微生物分类 ：选择性培养基（一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。 ） ；鉴别培养基（一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂， 从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如，伊红美蓝乳糖培养基（EMB） 。 ）另外一种就是天然培养基。 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液

11、、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。3.2存在问题目前的培养基虽能进行乳酸菌生产，但是，其有操作复杂、产量小、资源浪费、成本过高等不足之处。3.3 培养基优化设计的重用意义合理配置的培养基中各种营养物质成分达到最适比例，PH达到最适，溶解氧也达到了最适浓度，这样就给微生物创造了最适宜生长的环境条件，并且对环境产生的污染降到最低，实现了资源的循环利用。又能单位时间内生长最多的菌量。同时

12、减少了动力设备与加压设备，大大减少了成本，这对于一个生产企业来说无疑意义重大。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 12 页 - - - - - - - - - 6 4. 设计方案 4.1原材料制备41.1 菌种嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌及其混合菌，4.1、2 电子天平，酸度计，培养箱，电热恒温水浴锅，高压灭菌锅，放大镜冰箱4.1，3 玻璃仪器试管、三角烧瓶、试剂瓶、刻度吸管、平皿等4.1,4 实验室试剂浓度为 1mol/L 的 NaOH， ；体积分数为 75的

13、乙醇；M17 合成培养基、酸化MRS 培养基；质量分数为10脱脂乳液的配制：取150g 脱脂奶粉，加入 1350mL 的蒸馏水中，配成 10%的脱脂乳液，备用 4.2菌种的选择4.2.1 酸奶的特征微生物菌落计数9及菌落形态将样品以十进制稀释后， 取适当的稀释度分别接种，应用选择性培养基倒平板；MRS 培养基，在37下培养 72h，计算其保加利亚乳杆菌的菌落数；M17 培养基，在 37下培养 48h，计算其嗜热链球菌的菌落数。4.2.2 绘制球菌和杆菌及混合菌的发酵曲线取已知含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌量的牛乳，在相同的温度下，各取1 种单独培养，同时也使2 种菌按一定的比例混合后培养， 随

14、着时间的变化分别测定其酸度值，然后绘制曲线，其操作步骤如下。（1）取质量分数 10%的脱脂乳液 600mL， 分装于 3个烧瓶中，每个烧瓶装入 200mL，于 105下高温蒸汽灭菌15min。（2）无菌室（超净台）中的分别接种。取装有接种菌种牛乳的试管，摇匀里面的牛乳。用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳1mL，注入 1 个烧瓶中， 用吸管吸取含保加利亚乳杆菌的牛乳 10mL， 注入第 2个烧 瓶中， 然后， 用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳0.5mL，同时用吸管吸取含保加利亚乳杆菌的牛乳5mL，一起注入第 3 个烧瓶中，并均编号（3）将 3 个烧瓶密封，充分振摇，然后将其都放在42的培养箱中恒温培养。每

15、隔30min 测定 1 次 3 个烧瓶中牛乳的酸度。做出其酸度随时间变化的曲线。【测定酸牛乳的酸度（吉尔涅尔度） 】 。取 10mL 酸牛乳，用 20mL 的蒸馏水稀释，加入0.5mL 体积 分数为 0.5%的酒精性酚酞指示剂，以浓度0.1mol/L 的 NaOH 滴定，将消耗的NaOH 体积（ mL）数乘以10，即每 100mL 牛乳中所需要的浓度为0.1mol/L 的 NaOH 的毫升数为 1T， 称为 1吉尔涅尔度。一般牛乳的酸度超过20T，即可认为该牛乳已开始变酸。酸度越高，对热的稳定性越差，越易凝固。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - -

16、 - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 12 页 - - - - - - - - - 7 由图 1 可得知，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌单独作为发酵剂时，它们在开始阶段的发酵速度比混合菌的快，其中，嗜热链球菌的发酵速度又较保加利亚乳杆菌快。随着发酵时间的延长，嗜热链球菌的发酵速度开始减小，保加利亚乳杆菌的发酵的速度也开始减小，但混合菌的发酵速度逐渐加大，并且在2h 后混合菌发酵牛乳的酸度分别超过杆菌的和球菌的，酸度明显提高；12h 后，其酸度远远超过单菌的。品尝酸奶时，发现混合菌发酵的酸奶口感更好. 有一上可知混合菌的发酵条件比单菌的更好更有价值，

17、但如何搭配这两种菌使其得到更加优化的乳酸菌呢？现就设计不同比例的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵条件来得出使乳酸菌增菌的最佳混合菌的比例。绘制不同比例的混合菌发酵曲线：将菌种混合后，在相同的温度下培养，测定菌种的比例，并随着时间的变化分别测定其酸度值，然后绘制曲线，具体操作步骤如下。（1）取配制好且灭菌的质量分数10%的脱脂牛乳1000mL，分装于5 个烧瓶，每瓶200mL，分别接种。第1 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.75mL 和含保加利亚乳杆菌的牛乳 2.5mL； 第 2 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.5mL 和含保加利亚乳杆菌的牛乳 5mL；第 3 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳

18、0.8 mL 和含保加利亚乳杆菌的牛乳2mL； 第 4个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.25mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳7.5mL；第 5 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.6mL 和含保加利亚乳杆菌的牛乳4mL。 分别标注发酵剂 1 号5 号。 （2） 取接种牛乳的 5 个烧瓶，每瓶中分别倒出50mL 于另一烧瓶中，编上号。培养前，取装混合菌的5 个烧瓶中的牛乳，用酸奶的特征微生物菌落计数法记数。将接种的 5瓶牛乳密封后， 放在 43的恒温培养箱里面培养。 将另 5 个烧瓶盖上塞子后，置于 43的水浴锅中，每5min 测定 5 个烧瓶里牛乳的酸度值。 （3）待到水浴锅中的烧瓶中的牛乳出现凝聚

19、时，将恒温箱中对应的烧瓶取出，测定其酸度，之后置于4的冰箱中储存。将菌种1 和菌种 2 每隔一段时间从冰箱中取出后，倒出30mL 测定其酸度，然后放回冰箱中继续储存。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 12 页 - - - - - - - - - 8 4.3 营养因子的比例设计结果 不同营养因子对嗜酸乳杆菌生长关系影响大小顺序为：玉米浆马铃薯汁牛肉膏乳糖际蛋白陈葡萄糖番茄汁帕拉金糖13 正交试验培养基中共取个营养因子：牛肉膏、乳糖、番茄汁、马铃薯汁、葡萄糖、玉

20、米浆、际蛋白胨采用 个因子个位级的正交表8（的 7 次方）设计试验，接种嗜酸乳杆菌采用二级发酵试验由个因子的值，得出它们作用的主次顺序为： 玉米浆牛肉膏乳糖际蛋白陈马铃薯汁番茄汁葡萄糖，分析得到下表：利用正交试验所优化培养基组成（即：玉米浆、牛肉膏、乳糖，加其他盐） ，进步用种乳酸菌进行发酵试验，验证培养基的发酵增菌效果并与培养基进行比较，分别接种种乳酸菌， 7发酵培养0，用平板计数法（无氧培养）进行检测，均进行次发酵，测定发酵液菌落数，结果见表名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - -

21、 - 第 8 页，共 12 页 - - - - - - - - - 9 4.4 理化条件的控制1、温度温度是影响微生物生长的最重要因素之一。从微生物整体来看：生长的温度范围一般在 -10 100 极端下限为 -30 ， 极端上限为 105300 .微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。一般而言，老龄比幼龄耐热，原核生物比真核生物耐热，非光合生物比光合生物耐热，结构简单的比结构复杂的耐热， 在富含蛋白质的培养基上生长的细菌耐热能力强。最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。选择最适温度应该考虑微生物生长的最适温度和产物合成的

22、最适温度。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。在各种微生物的培养过程中，各个发酵阶段的最适温度的选择是从各方面综合进行考虑确定的。例如，在四环素发酵中，采用变温控制，在中后期保持较低的温度， 以延长抗生素分泌期， 放罐前 24h 提高 23培养，能使最后 24h 的发酵单位提高50以上。又如，青霉素发酵最初5h 维持 30，6-35h为 25，36-85h 为 20，最后 40h 再升到 25。采用这种变温培养比25恒温培养的青霉素产量提高 147。2pH 值的影响微生物的生长 pH 值范围极广，从pH8 都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0 之间

23、。 同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对 pH 值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH 值尤其重要 ,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH 值要求不同。微生物生长最适pH 与产物形成最适pH 相互关系的四种情况。第一种情况是菌体的比生长速率 ()和产物的比生产速率 (Qp)都有一个相似的并且较宽的最适pH 范围；第二种是 Qp(或 )的最适 pH 范围很窄，而 (或 Qp)的范围较宽；第三种是和 Qp 有相同的最适 pH 范围，但范围很窄，即对pH 值的变化敏感；第四种， 和 Qp 都有各自的最适 pH 范围。属于第一种情况的发酵过程比较易于控制，第

24、二、三模式的发酵pH 须要严格控制，最后一种情况应该分别严格控制各自的最适pH。选择最适 pH 的原则是既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量。一般最适 pH 是根据实验结果来确定的，通常将发酵培养基调节成不同的起始pH 值，在发酵过程中定时测定、 并不断调节 pH，以维持其起始 pH 值，或者利用缓冲剂来维持发酵液的 pH。同时观察菌体的生长情况， 菌体生长达到最大值的pH 即为菌体生长的最适 pH。产物形成的最适pH 也可以如此测得。只有在最适pH 下菌种才能生长才能达到名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - -

25、- - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 12 页 - - - - - - - - - 10 最大菌种产量。3溶解氧的影响溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度亦如此，因此，需要不断通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。溶氧的大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响。如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。因为，为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，

26、并使发酵过程保持在最适浓度。最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关，这是由实验来确定的. 4.5总工艺流程列叙工艺流程：培养嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌对数期接种 将菌种放在 MRS 培养基培养 接种在三个烧瓶里中 改变营养因子条件 改变理化控制条件 37C 下培养 72 小时无菌室中接种 分装试管中 分别滴加含嗜热链球菌的牛乳1mL编号密封测定菌种含量 比较方差分析 得到最产量最大的培养基配方与理化条件。5. 预期结果结果表明优化后的培养基利用的营养因子为：玉米浆、牛肉膏、乳糖原 培养基的营养因子配比为：蛋白陈，牛肉膏，乳糖，葡萄糖 ，番茄汁，其中际蛋白陈价格昂贵（零售价格约元），而

27、优化后培养基的主要营养因子为玉米浆其为生产玉米蛋白的副产品，价格低廉（价格约一元 kg） ，进行酸处理后成本也不过一元。因此，优化后的培养基成本降低约，大大降低了成本。研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、 嗜酸乳酸菌，在优化后的培养基发酵液中， 培养 ，菌落数均高于原培养基发酵液的菌落数，达到护以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约0，同时使菌种数量达到最大。6 方案实施时可能出现的问题与对策（1）配料的 R 值因子 ,是影响乳酸菌生长浓度的主要因素。（2）微生物的生长 pH 值范围极广， 从 pH8 都有微生物能生长。 但是绝大多数

28、种类都生活在 pH5.09.0 之间。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 12 页 - - - - - - - - - 11 7、设计感受 7.1.关于本方案通过正交试验优化了乳酸菌发酵培养基,用价格低廉的原料 (如玉米浆等 )代替了价格昂贵的原料 (如际蛋白陈 ),用其发酵嗜酸乳杆菌 ,嗜热链球菌 ,保加利亚乳杆菌等 ,发酵液中菌落数均高于原MRS 培养基发酵液的菌落数 ,达到109.fu/mL 以上,取得了较好的效果 ,大大降低了乳酸菌的发酵成本,对乳酸

29、菌保健食品的开发具有实际意义。7.2. 关于自我这是大学阶段我第一次深入地对工厂加工工序进行设计，刚开始还感觉无从下手，可在我们小组的讨论分工下，慢慢就有了思路，团结的力量就是很伟大，这无形中培养了我们的团队观念和合作意识。通过自己筛选课题然后查资料解决问题，感觉对我动手解决问题能力的提高很有帮助。不过我发现自己知识真是太少了，生物专业知识不踏实，我必须努力学习，不然毕业后进工厂只能做力气活。同时我明白了科学实验必须有严谨的作风，端正的态度，扎实的专业知识和充分的准备，所以现在大学生的我们要努力用知识武装头脑，为不久的将来投入社会打下坚实的基础。总而言之，通过本次的课程设计使我获益匪浅，学到了

30、很多书本上学不到的知识，更重要的是使我的语言表达能力得到很大程度提升。最后再一次诚挚的感谢所有在设计中帮助过我的良师益友和亲爱的同学们。8 参考文献【1】徐中儒 .农业试验最优回归设计 . 北京:农业出版社,1988 【2】贵州农学院 . 生物统计附试验设计 . 北京:农业出版社,1983 【3】刘忠敏，林兴兵， 杨生玉 . 现代应用生物技术 . 北京： 化学工业出版社， 2004 【4】陶兴元，刘志国，田俊 . 生物工程概论 . 北京：化学工业出版社，2005 【5】诸葛健，沈微 . 工业微生物育种 . 北京：化学工业出版社， 2006 【6】鲍新华 . 生物工程 . 北京：化学工业出版社，

31、2008 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 12 页 - - - - - - - - - 12 指导教师评语：课程设计报告成绩：，占总成绩比例：课程设计其它环节成绩：环节名称：，成绩：，占总成绩比例：环节名称：，成绩：，占总成绩比例：环节名称：，成绩：，占总成绩比例：总 成 绩：指导教师签字：年月日本次课程设计负责人意见：负责人签字：年月日名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 12 页 - - - - - - - - -