2022年Trizol法提取细菌总RNA .pdf

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1、实验三Trizol 法提取细菌总 RNA一、实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍， 它可以破坏细胞使RNA 释放出来的同时，保护 RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织 (50-100 mg) 和细胞(5106)以及大量的组织 (1 g) 和细胞 (107) 均有较好的分离效果。 Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。二、主要试

2、剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC 水超净工作台 2.0 mL离心管（无 Rnase）移液枪 紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一） . 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA 1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液 2.0 mL 于 2.0 mL 离心管离心得菌体；2、 每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡 15 s， 室温静置 5 min 4，12000 g，离心 10 min ；取上清转入 ( 约 1 mL) 新的 2.0 m L离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿 (

3、0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s ；室温静置 3 min ；4, 12000 g, 离心 10 min ；小心吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。）4、 加入 1 倍体积的氯仿， 盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4，12000 g，离心 10 min ；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；5、 加入 0.5 mL 的异丙醇 (0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4，12000 g，离心 10 min ，RNA 沉于管底；小心吸去上清；6、加

4、 1 mL75% 的乙醇 ( 预冷) ，并轻柔颠倒， 洗涤沉淀； 4，7500 g，离心 5 min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min ；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 7、 各管用 30 L DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60温育 5 min ，分装，-80贮存 ( 可贮存 5 周) ；（二） . RNA 浓度的测定取 10 L RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL ，转入 预

5、先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中， 小心排除气泡， 以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。RNA 浓度(g/ L)= OD260 稀释倍数 (200) 40( g/mL)/1000纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.82.0 ，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚氯仿抽提。该值为 2.0 时，RNA 纯度为最高。（三） . RNA 质量检测将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测， 目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为，如果 23 S 和 16

6、S 条带明亮、边缘清晰，并且23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上，则 RNA的质量较好。(1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具，水平放置在工作台上；(2) 准确称取 0.15 g琼脂糖加入15 mL 1 TAE 中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解( 中火档 2 min) ，待冷却至 60时，加入 EB( 终浓度为L/mL)，充分混匀；(3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 35 mm，置于室温下凝固；(4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶 12 mm；(5) 用微量移液器将样品 8L 与上样缓冲液 2L 混合

7、并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照（ 2000bp）；(6) 盖上电泳槽盖，调节电压 100 V ，电泳 15min 左右；(7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存。四、注意事项1. RNA 制备的关键是要抑制细胞中的RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。 EP管及 Tip 头都要用 0.1%处理(0.1% DEPC 浸泡过夜后，高压蒸名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第

8、2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 气灭菌 ) 。用于 RNA 实验的试剂， 须使用 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。 最好在超净台内操作。2、提取时操作带一次性手套、口罩等，小心、细致、晃动及每次移液要轻；在操作过程中避免讲话等。 这样做的唯一目的就是两个， 一是小心 RNAse 的污染降解 RNA ；二是动作过度暴力破坏RNA 的完整性。3、电泳液需新鲜配制。 电泳槽和模具需预先进行处理。4. 一般 RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短

9、越好(这样也是为了减少外界RNAse 对RNA 的降解 )，跑完电泳立刻观察。5、需要用 EB染色， Genefinder 染色效果不好，其对双链DNA 的效果好。6、器材的处理：尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。（1） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37下处理 12 小时。（2） 然后在 120下高压灭菌 30分钟以除去残留的DEPC。RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -