2022年分子遗传学- .pdf

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1、杨 淑 琴 编二三年元月高等农业院校教材分 子 遗 传 学名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 13 页 - - - - - - - - - 1 前言一、分子遗传学的含义及研究的主要任务分子遗传学是分子生物学的一个重要分支，或者说是狭义的分子生物学。它依据物理、化学的原理来解释遗传现象，并在分子水平上研究遗传机制及遗传物质对代谢过程的调控。因此，分子遗传学是在生命信息大分子的结构、功能及相互关系的基础上来研究遗传与变异的科学（分子遗传学是研究生物性状遗传和变异的

2、分子基础和机理的科学） 。分子遗传学不同于一般的遗传学。传统的遗传学“主要研究遗传单元在各世代的分布情况” ，而分子遗传学则着重研究遗传信息大分子在生命系统中的储存、复制、 表达及调控过程。它的研究范畴如图所示：DNA RNA 蛋白质现象型信息源信息模板工作分子（生长分化发育代谢）中心法则应该强调的是，不能把分子遗传学单纯地理解成中心法则的演绎。分子遗传学的研究范畴要比中心法则广泛得多，它首先是遗传学；其坚实的理论基础仍然是摩尔根的基因论 。中心法则只是对基因、性状及突变在核酸分子水平上的解释。但是，从中心法则到性状的形成，仍然是一个复杂的甚至未知的遗传、变异与发育的生物学过程。由于突变是在活

3、细胞内发生的一种过程，这样的过程不能用 DNA的简单化学反应来说明，因此分子遗传学应该研究活细胞内与遗传变异有关的一切分子事件。而沃森（J.Watson ）和克里克（F.Crick ）的 DNA双螺旋模型在解释 DNA复制、转录以及折叠压缩成染色体等问题上还存在着不少困难和争论。其二分子遗传学不是核酸及其产物（蛋白质）的生物化学，因为分子遗传学研究的对象是分子水平上的生物学过程遗传及变异的过程。它研究的是动态的生命过程，而不是脱离生物体，在试管里孤立地研究生物大分子的结构与功能。因而有人认为分子生物学在很大程度上正变成定性的科学。以往几年的巨大成就表明，生命过程是由严格控制下进行的一些有序事件

4、所组成，如果在生物的发育过程中不同部分的出现是决定于分子的形态因子的扩散作用，那么它们要何种浓度才能满足正常的发育？这就需要研究活细胞内的动态的、整体性的分子事件才能作出比较真实的回答。而那种只管因（DNA/RNA ）果（蛋白质/酶） ，不管过程的定性式的研究是无法回答这类实质性问题的。要真正地在分子水平上了解遗传变异的本质，仅仅研究核酸或蛋白质的生物化学是远远不够的。对于那些从活细胞中分离出来的、 “干燥”了的生物大分子的化学研究是必要的；但决不是分子遗传学研究的中心内容，更不是它的全部内容。分子遗传学所研究的应该是细胞中动态的遗传变异过程，以及与此相关的所有的分子事件。很显然，这些事件决不

5、限于中心法则，也不限于核酸、蛋白质。二、分子遗传学的诞生和确立1953年，沃森（J.Watson ）和克里克（F.Crick ）通过 X-射线的衍射分析，结合查加夫（E.Chargaff ）的碱基配对原则，终于发现了 DNA的双螺旋结构，并提出 DNA半保留复制的设想，从而标志着分子遗传学的诞生。在这段时间里，遗传和变异的奥秘在分子水平上逐步地被揭示出来： 遗传密码的破译； 从分子水平上定义基因是一定遗传效应的一个 DNA节段；概括遗传信息的传递和表达的中心法则；操纵子调控规律的发现；半保留复制的论证等五大项研究奠定了分子遗传学的基础。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - -

6、- - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 13 页 - - - - - - - - - 2 第一章遗传物质遗传信息的载体第一节什么是遗传物质DNA 作为传递遗传信息的物质，它首先必须能够保证物种的连续性和适应进化的需要， 因此遗传物质必须含有生物学上有用的信息，这些信息必须能够稳定复制和稳定传递。其次，遗传物质必须能够自我表达，产生其他一些生物学分子乃至细胞和生物体，也就是说，必须要有某种机制将遗传物质中所含信息翻译成产品。此外，遗传物质还必须能够发生变异，因为生物进化要求遗传物质能够变异。自从埃费里证明脱氧核糖核酸（de

7、oxyribonucleic acid，DNA ）是一种能够将遗传信息从一个细菌细胞传递到另一个细菌细胞的物质以后，又发现某些病毒中核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）也是遗传信息的载体。经过大量深入研究，现在人们对DNA和 RNA分子的生物学特征已有了充分认识。DNA和 RNA分子的结构非常有规律，非常适合贮存遗传信息，细胞内有关的酶能够对贮存的信息进行复制、修复和阅读，所以 DNA和 RNA具备遗传信息载体的所有特征。一、DNA作为遗传物质除了少数的 RNA病毒之外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。DNA作为遗传物质有许多优点，其中最主要的是：1、 容量大，信息量大，

8、集成量高。(一个 1kb的基因，其可能的核苷酸排列顺序有 4100010602种) 2、表面互补、电荷互补，双螺旋结构说明了精确复制的机理。3、 核糖 2 位脱氧，在水溶液中稳定性好。也就是核糖的 2 位上没有自由羟基，这也就是 DNA这一主要遗传物质极其稳定的根本原因。特别是对于碱的抵抗力，在 pH11.5时，DNA链的一级结构几乎没有任何变化，而 RNA链在几分钟内降解为 2单磷酸核苷和 3单磷酸核苷。RNA碱水解生成一个 2 ，3环式单核苷酸中间产物，由于是一个五员环，稳定性较差，很快转变成 2单核苷酸和 3 单核苷酸，见图 1-1。 4 、可以突变，以求进化。5 、有 T无 U ，基因

9、组得以增大，而无 C脱氨基成 U带来的潜在危险。以胸腺嘧啶 T取代尿嘧啶 U是 DNA生物有别于 RNA生物的重大步骤。 胞嘧啶 C经氧化脱氨基就成为 U ，假如 DNA也和 RNA一样，没有 T而只有 U，那么由 C脱氨基而来的 U和名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 13 页 - - - - - - - - - 3 原来的 U 就无法区别，假李逵可以冒充真李逵，这样就不能保持遗传物质的稳定性。特别是像人这么大的基因组，其 DNA总长度达 30亿对碱基，C脱

10、氨基成 U的现象并不罕见，任何一个细胞都不能承受 CU带来的严重后果。以 T代 U根除了这种潜在的灾难，因为尿嘧啶DNA糖苷酶可以灵敏地识别 DNA中的 U而随时将其剔除。 由于 DNA中有 T无 U， 所以 DNA基因组可以大幅度扩增，生物体结构得以进化到高级、复杂的程度，才有可能出现人类。迄今已知 RNA生物，都是基因组小、结构简单的生物（图 1-2 、1-3 ） 。由 U转变为 T的代谢途径已经研究清楚。 这条代谢途径充分说明 U的出现在先， T在后。 DNA中以 T 代 U的进化历程尚不清楚，因为没有发现中间类型。迄今已知唯一含 U的 DNA生物是枯草杆菌噬菌体 PBS1 ，其基因组相

11、当大。自发现迄今已 30余年，是实验室常用的转导噬菌体。其遗传性稳定，唯一例外的是经常出现清亮噬菌斑，不知是否是由于 C脱氨基成为 U之故。二、RNA作为遗传物质RNA的碱基也分 4种 A、U、C、G，其稳定性不如 DNA ，存在 C U的可能，造成基因突变，故 RNA作遗传物质时基因、基因组不能太大。1、单链 RNA病毒“+ ”基因组 RNA可直接作为翻译蛋白质的模板， “”基因组 RNA不可直接作为翻译蛋白质的模板，先复制出“+”链，再翻译成蛋白质。由于寄主细胞不能复制 RNA ， 所以 RNA病毒必须提供 RNA转录酶 （RNA transciptase） ，寄主细胞才能复制其 RNA基

12、因组。 有些 RNA病毒具有 RNA转录酶， 在侵染期间将其带进寄名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 13 页 - - - - - - - - - 4 主细胞。有些 RNA病毒则利用病毒基因组的遗传信息，依靠寄主细胞来合成 RNA转录酶。单链 RNA病毒利用 RNA转录酶合成一条复制型 RNA链， 然后再以这条链为模板， 合成许多拷贝的病毒基因组 RNA 。复制型 RNA链不能包裹到病毒子中，只用作基因组 RNA复制的模板。有些病毒在感染周期中，单链的 RNA

13、分子在反转录酶（reverse transciptase）的作用下，可以反转录成单链的 DNA，然后再以单链 DNA为模板生成双链 DNA 。双链 DNA可以成为寄主细胞基因组的一部分，并同寄主细胞的基因组一起传递给子细胞。在一定条件下然后再以 DNA分子为模板合成病毒 RNA基因组。在反转录酶催化下，RNA分子产生与其序列互补的 DNA分子，这种 DNA分子称为互补 DNA分子（complementary DNA ） ，简写为 cDNA ，这个过程即为反转录。2、双链 RNA病毒植物、动物以至人，都可能携带呼肠孤病毒，呼肠孤病毒科的基因组是 10 、11或 12条双股 RNA 。3、类病毒类

14、病毒，基因组很小，只是一条 300 400个核苷酸的环状 RNA ，与病毒不同，类病毒只有 RNA组成，本身不编码任何蛋白质。但侵染性极强，致病性极高，能把大树折磨死。这导致了两个问题，类病毒的 RNA是如何复制的？它是如何影响被感染的植物细胞的表型的？类病毒的复制必须由宿主细胞的酶来完成，其 RNA可以作为复制模板。类病毒通过复制占有宿主细胞关键的酶，从而影响细胞的正常功能，所以它们通常是致病的。4、拟病毒拟病毒是病毒体内的一种小的环状 RNA ，称为 RNA2，以便和病毒本身的基因组 RNA1相区别。象质粒与细菌的关系，是病毒体内的病毒。自从发现 RNA拟酶（ribozyme 是指催化作用

15、的 RNA ，它具有酶的主要特征：专一性强、加快反应速度、反应前后酶分子保持不变）以来，人们发现 RNA拟酶集信息传递作用和酶学催化作用于一身，很可能是最初的遗传物质。因为很可能在原始的生命中，RNA所催化的断裂-连接反应是最早出现的催化过程。 根据从遗传信息到蛋白质合成的过程中 RNA的多方面作用，RNA很可能是生物体系中最早出现的大分子种类，RNA的催化功能必然出现在 DNA成为遗传信息载体之前，也就是说，在原始生命中，遗传信息载体是 RNA 而不是 DNA 。由于DNA 稳定性和空间结构方面的优势而取代 RNA成为主要的遗传物质，蛋白质以其侧链的多样性和灵活性而取代 RNA成为主要的催化

16、剂。即一个由 RNA世界到 RNA蛋白质世界，由RNA蛋白质到 DNA世界的进化图景，已被科学界广泛接受（无生命世界RNA生命世界RNA、蛋白质生命世界DNA生命世界） 。三、蛋白质可以作为遗传物质吗？蛋白质因其缺乏遗传表面，而且遗传嗅觉不灵敏，不能作为遗传物质，早已成为定论。 可是病原体阮粒（Prion ）的行为曾对中心法则提出了严重的挑战。朊粒是一种蛋白质传染颗粒， 它最初被认识到是羊的瘙痒病的病原体。 这是一种慢性神经系统疾病，在 200多年前就已发现。1935年法国研究人员通过接种发现这种病可在羊群中传染，意味着这种病原体是能在宿主动物体内自行复制的感染因子。朊粒同时又是人类的中枢神经

17、系统退化性疾病如库鲁病和克-杰氏综合征的病原体，也可引起疯牛病即牛脑的海绵状病变。以后的研究证明，这种朊粒不是病毒，而是不含核酸的蛋白质颗粒。一个不含 DNA 或RNA的蛋白质分子能在受感染的宿主内产生与自身相同的分子，且实现相同的生物学功能，即引起相同的疾病，这意味着蛋白质分子也是负载和传递遗传信息的物质。实践证明，朊粒确实是不含 DNA和 RNA的蛋白质颗粒，但它不是传递遗传信息的载体，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 13 页 - - - - - -

18、- - - 5 也不能自我复制，而仍是由基因编码产生的一种正常蛋白质的异构体。哺乳动物细胞里的基因编码产生一种糖蛋白 PrP 。人的 PrP基因位于 20号染色体短臂，PrP由 253个氨基酸残基组成。在正常脑组织中的 PrP称为 PrPc。在病变组织中的 PrP称为PrPsc。PrPc和 PrPsc是 PrP的两种异构体，PrP*是一种中间体，即 PrP*可以生成 PrPc，也可以生成 PrPsc。一般情况下，PrP* 的含量极少，所以生成的 PrPsc极少。可是外源的 PrPsc可以促使 PrP*变成 PrPsc。PrPsc的不溶性使生成 PrPsc的过程成为不可逆转。PrPsc在神经细胞

19、里大量沉积，引起神经细胞的病变，破坏了神经细胞功能。因此，PrPsc感染正常细胞后，可以促使细胞内生成更多的 PrPsc，PrPsc逐渐积累，需要有一个时间过程才会引发疾病，这也就是这种神经退化性疾病有一个很长的潜伏期的原因。所以说，PrPsc进入宿主细胞并不是自我复制，而是将细胞内基因编码产生的 PrPc转变成 PrPsc。由此可见，中心法则是正确的，至少在目前还是无需修正的。第二节 DNA 的结构及特征一、DNA的一级结构DNA的基本结构单位是脱氧核苷酸。脱氧核苷酸含有碱基、磷酸和脱氧核糖。碱基有四种：腺嘌呤（A） 、鸟嘌呤（G ） 、胞嘧啶（C） 、胸腺嘧啶（T） 。RNA的组成与 DN

20、A有许多类似的地方，但也有区别，RNA的核苷酸中含的是核糖，而不是脱氧核糖，碱基中没有胸腺嘧啶，而代之以尿嘧啶（U） 。多聚脱氧核苷酸（DNA片段）是一个没有分枝的长链。DNA链的形成主要由一个脱氧核苷酸上的-磷酸基和另一个脱氧核苷酸核糖上的 3- 羟基共价连结。 3 、 5- 磷酸二酯键在 DNA中是比较重要的，DNA的水解和酶解都发生在这个键上。早期以为 3 、5- 磷酸二酯键的变化很大，因而认为 DNA的结构也会比较乱，以后发现磷酸二酯键的转动都受一定的限制，所以 DNA的多聚脱氧核苷酸链是相当稳定的。二、DNA的二级结构（一） 、沃森-克里克(Watson-Crick)的右手双螺旋1

21、、主链一个 DNA分子包括两条多核苷酸链，一条的走向从 5 到 3 ，另一条的走向从 3 到 5 ，亦即一条链对另一条链是颠倒过来，称为反向平行。这两条核苷酸链以一定距离平行地围绕着同一个轴盘旋着，形成一个右旋的双螺旋体。这两条多核苷酸链中的戊糖（S ）和磷酸（P）排列在外侧，这是由核糖和磷酸的亲水性所决定，形成链的主干，亲水位于外侧，疏水位于内侧。DNA双螺旋分子直径为 20 ?。核糖平面与螺旋轴平行。2、碱基配对碱基排列在内侧， 两链相对应的核苷酸之间的碱基彼此相对， 中间由氢键把它们连接起来。A与 T通过形成的 2个氢键相连接， C与 G则通过形成的 3个氢键而配对， 因而在数量上 A=

22、T，G=C ，因此嘌呤的总含量和嘧啶的总含量是相等的 A+G=T+C ，这一规律称为“当量规律” 。碱基平面与螺旋轴基本上是垂直的。3 、螺距双螺旋链中的任意一条链绕轴一周（360 ）所升降的距离叫做螺距。这个模型的螺距为3.4nm （34 ?） ，其中包括 10bp ，因此每两个相邻碱基平面的垂直距离为 3.4? （ 0.34nm ） ，相对于螺旋轴移动 36 （也称螺旋扭角） 。4、沟沿螺旋轴方向观察， 两条主链和碱基并不充满双螺旋的空间， 双螺旋的表面形成两条凹槽，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整

23、理 - - - - - - - 第 6 页，共 13 页 - - - - - - - - - 6 一条宽而深，叫做大沟，一条狭而浅，叫做小沟。之所以形成大沟和小沟，是因为从螺旋轴心到两条主链所划分出的两个扇形不等，一个大于 180，一个小于 180。这两条沟，特别是大沟，对于在遗传上有重要功能的蛋白质识别 DNA 双螺旋结构上的特定信息是非常重要的，因为只有在沟内，蛋白质才能“感觉”到不同碱基顺序，而在双螺旋结构的表面全是相同的磷酸和脱氧核糖的骨架，是没有什么信息可言的（图 1-4） 。沟的深与浅主要决定于螺旋轴的位置， 而沟的宽窄主要决定于两个糖苷键与碱基对的相对位置和糖苷键的顺反构象。螺旋

24、轴在哪个沟中，哪个沟就深。（二） 、DNA 二级结构的稳定因素 DNA 的二级结构是很稳定的，这是由以下的因素所造成。1、碱基对之间的氢键在双螺旋中嘧啶和嘌呤之间的距离正好与一般氢键的键长（0.17nm ）相一致。且供体，氢原子和受体原子处于一直线上，利于形成氢键。氢键的形成有助于 DNA复制、修复、重组、转录、翻译，以及各种分子杂交等。2、碱基的堆集力此是碱基对之间在垂直方向上的相互作用所产生的力（见图 1-4） 。它包括：、疏水作用DNA 的主链部分是亲水的， 碱基的外围基团氨基和酮基也是亲水的，但嘧啶和嘌呤本身带有一定程度的疏水性。因此在水溶液中，这些疏水基团自发聚集。、范德华力在双螺旋

25、中相邻碱基对的间隔的 0.34nm ，而范得华力的半径（指引力和斥力正好相平衡的距离）平均为 0.17nm 。碱基间相互作用的强度与相邻碱基之间环的重叠面积成正比。这样范得华力加强了疏水作用力。、磷酸基的负电荷斥力名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 13 页 - - - - - - - - - 7 核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷， 因此双链之间存在着静电的排斥作用。 当在溶液中加入盐类时，正离子（Na+）可以和负电荷结合，围绕在磷酸基团的周围形成离子云，从而屏

26、蔽了静电斥力。在处于生理盐水浓度（0.02mol/L）时就可发生这种屏蔽作用，斥力被中和，那么两条链就不易分开。（三） 、二级结构的多种构象前面介绍的双螺旋模型仅是 DNA 双螺旋多种构象中的一种，称为 B-DNA ，存在于生理条件下，在一定条件下双链 DNA 可以从 B型转变成其他的构象。双螺旋的构象现已知有 A 、B 、C 、D 、E、T等右手双螺旋构象以及左手双螺旋的 Z构象 7 种（表 1-1，图 1-5） 。表 1-1 A ，B，C，Z型双螺旋的 特性双螺旋类型每螺旋内碱基对数每对碱基的转角每碱基对的间距（?）直径（nm ）存在的条件大沟小沟中轴位置相对湿度盐的种类A 11 34.7

27、（右旋）2.56 2.3 75% Na+，K+，Cs+窄深宽浅大沟B 10 34.0（右旋）3.38 1.9 92% Na+，低盐宽中等深窄中等深碱基对C 9.33 38.6（右旋）3.32 1.9 66% Li+宽中等深窄中等深碱基对Z 12 -30（左旋）3.71 1.8 43% Na+，Mg+，高盐平浅窄深小沟A构象是在以 Na+、K+或 Cs+作为反离子时将 DNA 纤维在 75% 的相对湿度下进行 X-光衍射测定出来的。DNA-RNA杂交，RNA-RNA双链结构均采取 A构象。C构象是以 Li+为反离子时在 66%的相对湿度下测定出来的，双螺旋直径与 B 构象大体相同（1.9nm ）

28、 ，而每圈螺旋的碱基对数为 9.33，目前尚无证据说明生物体内有 C型 DNA 的存在。D构象和 E构象仅适用于缺少 G C名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 13 页 - - - - - - - - - 8 对的 DNA 分子， 每圈螺旋的碱基对数分别为 8和 7.5。 而左旋 Z型只是在特殊碱基序列处形成，并在细胞中或许不是重要的构象，Z构象之所以为 Z型，是因为其脱氧核糖-磷酸骨架按之字形路径从一端伸向另一端。下面，我们比较一下 B-DNA ，A-DNA

29、 和 Z-DNA 的结构特征。1、B-DNA 双螺旋右手双股螺旋；每圈螺旋 10个碱基对，螺旋扭角为 36；螺距 34 ?，每 个碱基对的的螺旋上升值为 3.4 ?；碱基倾角-2，碱基平面基本与螺旋轴垂直；螺旋轴穿过碱基对，大沟宽而略深，小沟窄而略浅（图 1-6） 。2、A-DNA 双螺旋右手双股螺旋；每圈螺旋 11个碱基对，螺旋扭角为 33；螺距 28 ?，每 个碱基对的螺旋上升值为 2.56 ? ；碱基 倾角 13，碱基平面不再与螺旋轴垂直；螺旋轴不穿过碱基对，而是位于大沟中，碱基对在小沟中围绕着螺旋轴，形成中空结构；小沟宽而浅，大沟极深，其深度为从螺旋表面经过螺旋轴再向对面延伸一段距离（

30、图 1-6） 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 13 页 - - - - - - - - - 9 3、Z-DNA 左手双螺旋左手双股螺旋；每圈螺旋 12个碱基对，螺旋扭角为51（G C ）和 9（C G ） ；螺距46 ?，每个碱 基对的螺旋上升值为 3.5 ? （ G C ）和 4.1?（ C G ） ；碱基倾角 9，即碱基平面不与螺旋轴垂直；螺旋轴不穿过碱基对，而是位于小沟中，大沟已不复存在，小沟窄而深；两条链上的磷酸基隔着狭窄的小沟面对面。在 B型

31、DNA 中，苷键的构象都是反式（anti ） 。而在 Z型 DNA 中，嘧啶核苷酸中的苷键为反式取向，嘌呤核苷酸的苷键为顺式（syn）取向（图1-7） 。三、超螺旋自从 1965年 Vinograd 等人发现多瘤病毒的环形 DNA 的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环（covalently closed circle）简称 CCC 分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构。有些单链环形染色体（如 ?174 ）或双链线形染色体（如噬菌体） ，在其生活周期的某一阶段，也必须将其染色体变为超螺旋形式。超螺旋又分正超螺旋（按原螺旋的方向继续螺旋后形成的结构，导致绕双螺旋的张力更

32、大，使结构更加紧张，因此正超螺旋使过渡缠绕的超螺旋）和负超螺旋（与原来螺旋的方向相反继续螺旋形成的结构， 因此负超螺旋的作用是解旋） 。 闭合环状的 DNA 才能形成超螺旋， 如细菌和真核细胞中 （细胞器）的环状 DNA 为负超螺旋，但是真核细胞的染色质和一些病毒的双螺旋线形分子与组蛋白结合后，其两端不能自由旋转亦处于负超螺旋状态。根据构象超螺旋有两种形式： 一种是双链闭环 DNA 形成的相互盘绕式超螺旋。亦称同向超螺旋。多存在于质粒、线粒体、叶绿体和某些病毒中。另一种是螺线管式超螺旋。例如真核细胞染色质中的 DNA 。 （图 1-8） （图 1-9 ）图 1-8 DNA 正负超螺旋结构示意

33、图图 1-9 DNA 超螺旋形式a、相互盘绕式超螺 旋b、螺线管式超螺旋四、DNA双螺旋结构的呼吸作用在 DNA双螺旋结构中， 配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡之中，这种过程通常称为 DNA链的呼吸作用。特别是在富含 AT 的节段，呼吸作用更为明显，经常发生瞬间的单链泡状结构，这对于某些特殊的蛋白质与 DNA发生反应并阅读 DNA链内部储藏的信息（包括氨基酸编码）具有重要作用。五、DNA 的变性与复性1、DNA 变性碱基配对的氢键和碱基平面之间的疏水力是稳定 DNA 双螺旋结构的两种力。 因此， 凡是破名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - -

34、 - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 13 页 - - - - - - - - - 10 坏氢键和疏水力的因素都能破坏双链之间的氢键（如加热，有机溶剂、尿素、酰胺等试剂） ，使双链解开。DNA 双链分离的过程叫变性。DNA 的变性，不仅受外部条件的影响，而且也取决于 DNA 分子本身的稳定性。如 G C含量高的 DNA 分子就比较稳定。因为 G C之间有三个氢键，而 AT之间只有两个氢键。环状 DNA 比线状 DNA 稳定。当将 DNA 的稀盐溶液加热到 80100 时，双螺旋的结构即发生解体，两条链分开，形成无规则线团。DNA

35、变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内，并导致一系列的理化性质发生剧烈变化，如 DNA 变性后由于分子构象的变化，溶液的粘度大大降低，有序的碱基排列被打乱了，于是对 260nm 波长的光密度吸收值大大地增加。这种对光密度吸收值增大的现象称为“增色效应” 。如当浓度都为 50ug/ml时，双螺旋 DNA 的 A260=1.00；单链DNA 的 A260=1.37；碱基或核苷酸的 A26 0=1.60。当缓慢而均匀地（如 0.1/分）增加 DNA 溶液的温度，记录各个不同温度下的 A260数值，即可绘制成 DNA 是溶解曲线，如图 1-10所示。A260急剧变化的温度范围一般为

36、68。当A26 0增加到最大增值的一半时，即相当 A2 60值达到约 1.185 时，这是的温度叫做 DNA 的解链温度（Tm ）或熔点（把 DNA 的双螺旋结构失去一半时的温度） 。或者说是变性温度范围的中点。在生理条件下 Tm 一般在 8595。影响变性的因素有外部条件和内部结构二类。 外部条件如温度和正离子的浓度。 本身的结构主要是和 G C含量及分子类型有关。当 G C含量上升 1% ，则 Tm上升 0.4，马默多蒂（Marmur-Doty ）关系式：Tm=69.3+0.41 （G+C ）% ，或 GC%=（Tm-69.3 ）2.44。通过这个关系式，我们可以通过 Tm 的测定，推出

37、GC 含量。或已知 GC 含量，可推出 Tm 。在进行 PCR 引物设计时要求一对引物的 Tm相近，就需要考虑 GC 含量和引物的长度来调整其Tm 。另外 DNA 分子的类型不同 Tm也不同，环状比线状稳定，所以其 Tm 高于线状分子的 Tm 。2、DNA 复性变性 DNA 的两条互补链在除去变性因素后，可以重新结合，恢复成双螺旋结构，这个过程称 DNA 复性。不完全变性易恢复，恢复时间短；易变性的地方难恢复。复性的过程：当两条链互相碰撞，一条链的某个区域遇到了互补的另一条链的配对碱基时，就在这个区段形成双链核心。然后从核心向两侧对应互补链扩大互补配对，最后完成复性过程。复性后的 DNA 一系

38、列物理、化学性质得到恢复。如消光值降低，粘度增高。浮力密度下降，恢复部分生物活性等。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 13 页 - - - - - - - - - 11 与 DNA 复性有关的因素：、DNA 分子的大小和顺序复杂性与复性的关系简单顺序的 DNA 分子，彼此发现互补链比较容易，因此很快就复性了。复杂顺序的 DNA分子，在分子互相碰撞过程中，必然会碰到很多非互补链，影响复性速度，即使有互补配对机会，有时也会出现错配，错配的区域还要解开，直到找到

39、正确的互补配对，才能完成复性。因此在同样条件下，顺序复杂的 DNA 比顺序简单的 DNA 所需的复性时间要长。另外 DNA 片段大，扩散慢，互补链碰撞的机会少，复性也较慢。、样品的浓度同一种 DNA ，当浓度高时，互补顺序相碰的机会增加，复性就比较快。、溶液的离子强度如果两条单链 DNA 带有很多同性电荷，它们会互相排斥，互补区域碰撞机会少不易结合，因此在复性溶液中必须有一定的盐浓度，以减少斥力，加快复性速度。、温度温度低时，分子运动的速度减慢，减少了互补链的碰撞机会，同时增加了错配链解链的困难。因此复性一般要求在比融点温度（Tm ）低 25的条件下进行最好。3、复性动力学复性动力学是用来检验

40、基因组 DNA 的复杂性的一种方法，它主要包括下列步骤：、纯化了的 DNA 通过高速搅拌或从小孔喷出剪切成为小的片段。控制搅拌的速率可以取得大小均一的片段，例如常采用的 400bp的片段；、100 短时间处理后迅速冷却使变性；、在标准的磷酸缓冲液中保温；、每隔一定时间测定复性 DNA 的量。DNA 复性是一种双分子二级反应，单链消失的速度可用下面公式表示： （-dC/dt=-kC2） ，其中 C为 t 时间时单链 DNA 的浓度，单位是每升的核苷酸摩尔数（mol/L） ；t 为时间，单位是秒（s） ；k 是二级反应常数，单位是升/moL秒。k 值取决于阳离子浓度、温度，片段大小和DNA 分子序

41、列的复杂性。上面公式可以重排为（-dC/ C2=-k dt） 。当 t=0 时，C= C0，将上式积分：-（1/ C0-1/C）=kt，即 1/C-1/ C0=kt，可重排成 C/ C0=1/（1+k C0t ） 。在上式中，当 t=0 时， ，C= C0，表示所有的 DNA 都是单链。C0为 DNA 的总浓度。在一个特定的实验中，C0是已知的，C浓度是可以测定的，复性的分数 C/ C0是起始浓度和经过时间的乘积 C0t 的函数，这样的函数可以绘成下面的图（1-11） ，称为 C0t 曲线。反应进行到一半时，C/ C0=1/2，这时 C0t 值定义为 C0t1/2，C/ C0=1/（1+kC0

42、t1 /2）=1/2，C0t1/2=1/k。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 13 页 - - - - - - - - - 12 各个不同的 DNA 的 C0t1/2 完成一半 DNA 复性反应所需的 C0t ， （C0t 是 DNA 复性反应中 DNA浓度与保温时间的乘积。 ）与复性 DNA 的长度成正比。值是不同的，不仅与 k 值相关，而且DNA 分子序列的复杂性影响 k值。DNA 分子序列的复杂性 X值定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值。例如

43、（ATATAT, ），其 X值为 2， （ATGC）n的 X值为 4，没有重复序列的含有105核苷酸对的 DNA 分子的 X值为 105。在 DNA 总浓度（以核苷酸为单位）相同的情况下，片段越短，片段浓度就越高，复性所需的时间 t1/2也越短，C0t1/2也越小，因此，X值与 C0t1/2的关系是 X=k C0t1 /2。其中，比例常数 k将取决于反应条件（阳离子浓度，片段大小等） ，在通常使用的标准状况下（0.18 当量的阳离子，片段大小 400个核苷酸） ，k5105（升核苷酸对/核苷酸 mole 秒） ，即在此条件下，X=5 105 C0t1/2（核苷酸对） 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 13 页 - - - - - - - - -