基因工程2006复习题.doc

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流基因工程2006复习题【精品文档】第 15 页一、填空1、基因工程是（ 70 ）年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生，使人们从简单的利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代走向（ 按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种 ）的时代。2、（ 1970 ）年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离得到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为（ HindII ），这是第一个被分离到的II类限制性内切核酸酶。4、pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于（ pMB1 ），它的四环素抗

2、性基因来自于（ pSC101 ），它的氨苄青霉素抗性基因来自于（pSF2124（R质粒） ）。6、在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是（ 螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性）。7、Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别：1) （ 印迹的对象不同：Northern是RNA，Southern是DNA； ）；2) （ 电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件 ）。8、PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于（ 插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选 ）。9、乙醇沉淀DNA的原理是（ 乙醇使DNA分子脱水 ）。10、 引

3、物在基因工程中至少有4个方面的用途：1) （ 合成探针 ）；2) （合成cDNA ）； 3) （ 用于PCR反应 ）；4) （ 进行序列分析 ）。11、野生型M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是（基因 ）和（ 基因 ）。13、重组体的筛选有两层涵义，一是将（ 携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来 ）；二是将（ 携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来 ）。14、产生平末端的方法通常有：1）（ 平切的酶 ）；2）（S1核酸酶切除粘性末端 ）；3）（ DNA聚合酶补平粘末端 ）。13、 15、通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段

4、，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的（限制性酶切图谱）。16、部分酶切可采取的措施有：1) （ 减少酶量 ）；2) （ 缩短反应时间 ）；3) （ 增大反应体积 ）等。18、假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： 1) （保持正确的可读框 ）； 2) （ 能够使其转录的启动子 ）； 3) （ 具有翻译的起始和终止信号 ）。14、 受体细胞的感受态是（ 接受外源DNA的生理状态。 ）。19、 DNA重组连接的方法大致分为四种：1）（ 粘性末端连接 ）；2）（ 平末端连接 ）；3）（ 同聚物接尾连接 ）；4）（ 接头连接法 ）。15、 限制性内切核酸酶通常

5、保存在（ 50% ）浓度的甘油溶液中。24、为了防止DNA的自身环化，可用（ 碱性磷酸酶 ）去双链DNA（ 5端的磷酸基团 ）。16、 25、就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（ 复制区： 含有复制起点 ）、（ 选择标记： 主要是抗性基因 ）、（ 克隆位点： 便于外源DNA的插入 ）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 27、克隆基因的主要目的有四：1）（ 扩增DNA ）；2）（ 获得基因产物 ）；3）（ 研究基因表达调控 ）；4）（ 改良生物的遗传性。 ）。29、噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是（ 它在细菌中能够大量繁殖，这

6、样有利于外源DNA的扩增 ）；二是（ 对某些噬菌体的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究的比较详尽。 ）。30、在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：1）（ 可以扩增质粒DNA ）；2）（ 抑制了菌体的数量，有利于裂解 ）。31、基因工程是（ 70 ）年代发展起来的遗传学的一个分支学科。32、限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自（ 属名的第一个字母 ），第二、三两个字母取自（ 种名的前两个字母 ），第四个字母则用（ 株名 ） 33、野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是（ 没有合适的限制性内切核酸酶识别位点 ）

7、和（ 选择标记 ）。36、根据Northern杂交的结果可以说明：（ 外源基因是否进行了转录 ）。37、M13单链噬菌体的复制分为三个阶段1）（ SSRF ）；2）（ RFRF ）；3）（ RFSS ）。38、酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用：1）（ 使蛋白质变性 ）；2）（ 由于它能使蛋白质变性，故也能使核小体和核糖体解聚，释放出DNA和RNA，提高DNA的得率 ）。41、基因工程的两个基本特点是：1) （ 分子水平上的操作； ），2) （ 细胞水平上的表达； ）。43、（1970 ）年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离得到一种限制酶，能够特异性的切割DNA

8、，这个酶后来被命名为（ Hind II ），这是第一个被分离到的II类限制性内切核酸酶。44、基因工程中有3种主要类型的载体：（ 质粒DNA ）、（ 病毒DNA ）、（ 质粒和病毒DNA杂合体 ）。45、随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过（ 细菌发酵 ）、（ 真核细胞培养 ）和（ 乳腺生物反应器 ）等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究和治病。46、部分酶切可采取的措施有：（）（ 减少酶量 ）；）（ 缩短反应时间 ）；）（ 增大反应体积 ）。47、为了防止DNA的自身环化，可用（ 碱性磷酸酶 ）脱去双链DNA（ 端的磷酸基团 ）。48、人工感受态的大肠杆菌

9、细胞在温度为（ ）时吸附DNA, 温度为 ）时摄入DNA。49、基因克隆中三个基本要点是：（ 克隆基因的类型 ）；（ 受体的选择 ）和（ 载体的选择 ）。50、EDTA是（ Ca2+ ）离子螯合剂。51、欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用（ S1核酸酶切割 ）或（ DNA聚合酶补平 ）。52、目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为： 1) （遗传学方法 ）；2) （ 物理筛选法 ）；3) （ 核酸杂交法 ） ；4) （ 表达产物分析法 ）等。53、只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用（ PCR

10、）可以将这段DNA进行百万倍的扩增。54、有两类改造型的噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为（ 1 ）个，取代型为（ 2 ）个。55、M13噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即（1）（ 正链复制起点 ）；2）（ 负链复制起点 ）；3）（ 包装信号 ）。60、Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的（ T载体 ）。61、DNA重组连接的方法大致分为四种：(1) （ 黏性末端连接 ）；2) （ 平末端连接 ）；3) （ 同聚物接尾连接 ）；4) （ 接头连接）。63

11、、噬菌粒载体是一类由（ 丝状噬菌体DNA复制起始位点序列 ）与（ 质粒 ）组成的杂合分子。64、基因工程操作的三大基本元件是（ 供体 ）、（ 受体 ）和（ 载体。 ）。65、 基因文库的构建方法包括 （ cDNA 法 ）和（ 鸟枪法 ）。66、噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是（它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增 ）； 二是（ 对某些噬菌体(如l噬菌)的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽 ）。71、在（ Southern印迹 ）技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的D

12、NA探针杂交。基因工程的定义：在体外将核酸分子插入病毒,质粒或其它载体系统中,构成遗传物质的新组合再整合到那些本来不含该类物质的宿主中 ，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。、Clone:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的特征：跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。基因工程的主要操作内容：目的基因的获取从复杂的生物基因组中

13、，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。三大基本元件：供体、受体、载体。基因工程诞生了：Berg的开创性实验1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与l噬菌体的DNA片断连接起来。基因工程的安全隐患：对环境的影响重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生

14、态环境带来不良影响。新型病毒的出现制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。癌症扩散将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。实验室的物理安全：P1级实验室一般装备良好的普通微生物实验室。 P2 级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。P3 级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜。P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施。大肠杆菌：EK1级的大肠杆菌在自然环境中一般都要死亡。EK2-EK3级大肠

15、杆菌在自然环境中无法存活。一碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。所用的试剂作用：溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDNaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，

16、并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。乙醇用于沉淀DNA（DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境）。RNase A降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制（ris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解）。酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶

17、液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。影响质粒DNA产量的因素：受体菌株，质粒拷贝数（这是直接决定DNA产量的重要因素之一，质粒本身的性质所决定），质粒大小（分子量大的质粒，拷贝数少）。电泳时质粒DNA速度：闭合环状卷曲超螺旋线性分子伸展开环状琼脂糖凝胶的分辨力:空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。EB染色原理：EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比

18、。核酸的分子杂交指：分子杂交技术是分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测待测混合样品中特定的核酸或蛋白质等生物分子是否存在、存在的具体部位、含量的高低，以及其相对分子质量大小本生物信息。分子杂交技术原理：分子杂交是指在DNA变形后，在复性的过程中两个不同来源的，但同源的核酸分子形成杂合双链的过程，在以上过程中，当采用一个标记的核酸分子与待测核酸样品杂交，便可检测待测样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。Southern blot：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。Northern blot：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。PCR原理：DNA模板变性双链DNA

19、在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。DNA模板与引物复性。DNA链的延伸DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。PCR的过程：第一步 变性94-95 下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。第二步 复性50-60 下1分钟，引物优先与模板复性。第三步 延伸72 下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。第四步变性94 下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。第五步 重复。PCR加入试剂顺序由便宜到贵。影响 PCR的因素：Taq DNA聚合酶 热稳定性 最适温度高 Taq酶的功能缺点（有5-3聚合酶活性和5-3外切酶活性，但没有3-5外切酶活性

20、。因此不能修复错误的碱基配对！） Taq DNA聚合酶的激活剂（金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。引物位置引物的长度（一般引物设计为长1530bp）引物的碱基序列引物的碱基组成（1.尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力2.避免连续相同相同碱基排列或内部回文序列3.避免形成引物二聚体两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补）。引物的Tm值引物的浓度简并引物套嵌引物二限制性内切酶，首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是Hind 酶的命名原则：前三个字母斜体，第一个大写来源于属名第一个字母，后两位小写来源于种名前两位。用正

21、体字母代表菌株或型。不同体系加罗马字母。如Hind。同裂酶:识别位点的序列相同的限制性内切酶。完全同裂酶识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶识别位点相同，但切点不同。同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。影响限制性内切酶活性的因素：外因可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等。内因内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象（构象的影响主要指切割线性 DNA 和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 lDNA 相比， EcoR、Pst、Sal 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺

22、旋 DNA）.酶的纯度，DNA纯度，DNA甲基化，温度，缓冲液，DNA分子结构。DNA 连接酶： 特点：大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端。T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。 连接条件：两条双链DNA，DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。需要能量（动物或噬菌体中：ATP，大肠杆NAD+） 连接反应的温度：连接酶反应的最佳温度是37，但在37下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用 416。 影响连接反应的因素：插入片段与载体的浓度比例（1020倍）， 反应温度。 DNA修饰酶： 末端脱氧核苷酸转移酶：来源小牛胸腺，大小两个亚基组成，特性：（1） 5-3DNA聚合

23、酶活性，不需模板，随机添加的dNTP底物可以是单链DNA，是3OH突出的双链DNA，平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 用途：同聚物加尾，再生酶切位点，非放射性标记DNA片断的3端 T4多核苷酸激酶：催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。用作：1，DNA或RNA的末端标记，用作寡核苷酸探针和进行DNA测序2，寡核苷酸5端的磷酸化3，除去3磷酸基团。 碱性磷酸酶：催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。功能：（1）防止线性化的载体份子自我连接，（2）在5端标记之前，去除DNA或RNA分子的5端磷酸基团。三什么叫 载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DN

24、A分子叫载体。载体类型：质粒，单链DNA噬菌体M13，噬菌体的衍生物，柯斯质粒，动物病毒。基因工程对载体要求：（1）在宿主细胞内能独立复制。2）有选择性标记。3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。4）分子量小，拷贝数多。5）容易从宿主细胞中分离纯化。质粒的定义：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。pBR322来源： 复制起点 ori Ampr基因 Tetr基因长度：4363bp选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。克隆位点：24个克隆位点。9个会导致Tetr基因失活，3个会导致Ampr基因失活。优点： 双抗菌素抗性选择标记 分子小，克隆能力大 高拷贝数 安全（

25、失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移）缺点：保留了转移蛋白（mob）的作用位点。改进： 删除mob识别位点 改造EcoR I 位点（使EcoRI 也成为插入失活型位点。）M13 噬菌体：（1）寄主（只感染雄性大肠杆菌，但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌）（2）DNA长度（6407 bp）3）DNA提纯（成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取）M13的生活周期：M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA、+DNA合成DNA，形成RF dsDNA、DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白、组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞五外源DNA导入细菌

26、的几种方法：1）转化（大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。）2）转染（大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程）3）转导（借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。）受体细胞：实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定遗传的细胞，实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。感受态细胞：能够吸收 DNA 的细胞受体细胞的选择基本原则：1、便于重组DNA分子的导入。2、能使重组DNA分子稳定的存在于细胞中3、便于重组体的筛选4、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长5、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性8、具有较好的

27、转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。影响转化率的因素：（1）重组质粒环形质粒数（2）感受态细胞生长状态必须在冰冷的条件下制备CaCl2处理储存感受态菌要在-70以下使用感受态菌时必须迅速融化（融化后一般不能再次冻存使用。）六筛选方法：载体表型选择法，根据插入基因的表型选择，DNA电泳检测法，PCR扩增检测法，核酸杂交检测法，免疫化学检测法，转译筛选法报道基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，从而在其表达后，使细胞表现出特定的可检测性状。此类基因所表达的蛋白活性已被确认，常被应用于转基因技术当中，如常用的编码绿色荧光蛋白（GFP）的基因。

28、类型：1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶2）细菌和萤火虫的荧光素酶3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因。二、名词解释1、 Plasmid ：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。 2、转染：以噬菌体为载体，用 DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。3、Gene engineering：在体外将核酸分子 插入病毒, 质粒或其它载体系统中 ,构成遗传物质的新组合再整合到那些本来不含该类物质的宿主中 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。5、星活性（star activity）：高浓度的

29、酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象6、；同裂酶：识别位点与切割位点均相同，但来源不同；7、转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体 DNA导入受体细胞。10、 同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。12、克隆:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。13、同位酶：识别相同的序列但切点不同14、限制性物理图谱：即限制性内切核酸酶作图（restriction mapping）简单地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位，即

30、DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。17、原位菌落杂交：根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法。它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落（或噬菌斑）原位溶菌，原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上，然后用放射性标记的探针同固定了的DNA进行杂交经放射自显影后，确定哪一个菌落含有重组的DNA分子，再从参比平板上选取重组体。18、简并引物：是指根据肽链的氨基酸序列（或部分序列），并充分考虑密码子的简并性而设计的、用于PCR扩增的混合引物群体，这种混合引物之间具有不同的

31、碱基组成，但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性，在这种混合引物中必定有一种引物是可以和该基因的DNA序列精确互补。20、穿梭载体：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主（来回穿梭）。21、感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体 DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。22、基因文库：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。2

32、3、感受态细胞：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态24、cohensive-end site25、S-D sequence26、受体细胞：受体细胞是指在转化和转导（感染）中接受外源基因的宿主细胞。受体细胞也叫宿主细胞三、简答1、简述DNA克隆过程?1、一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。2、简述存在于载体分子上的遗传标记基因的作用？2、1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子

33、。3、DNA操作酶根据其催化反应的类型可以分为哪5大类？并简述每一种类的基本催化反应类型。3、分为核酸酶、连接酶、聚合酶、修饰酶、拓扑异构酶这5大类。其中核酸酶的基本催化反应类型为切开、切除或降解核酸分子；连接酶的基本催化反应类型为将核酸分子连接起来；聚合酶的基本催化反应类型为复制核酸分子；修饰酶的基本催化反应类型为去除或添加化学基团；拓扑异构酶的基本催化反应类型为向共价闭合环状DNA中引入或消除超螺旋。4、载体应具备哪些条件？4、1)具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） ；2)具有合适的筛选标记；3)具有较高的外源DNA的载装能力；4)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；5)具有与

34、特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。5、-DNA作为载体有哪些优点？5、1)、-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；2)、-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量；3)、重组-DNA分子的筛选较为方便；4)、重组-DNA分子的提取较为简便；5)、-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段。6、在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 6、回文序列是：5-CATATG-3，7、PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?7、 (1)DNA半保留复制的原理，在体外

35、进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。9、基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。请分别指明上游技术和下游技术的具体含义？9、上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程10、简述标记基因的种类？10、抗性标记基因、营养标记基因、生化标记基因、噬菌斑。11、简述限制性内切酶的命名原则？11、1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成三个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示。2）用一个字母

36、代表菌株或型。3）以罗马数字表示同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。12、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？12、化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。13、简述为什么噬菌体或病毒可以被开发成为基因工程载体？13、这主要是由于噬菌体或病毒具有被开发成为基因工程载体的特性：一方面其高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；另一方面其自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。14、下面几

37、种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是类酶的识别序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 为什么?14、GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。15、欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如Ecoli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题?15、应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。16、什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?16、Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。17、

38、简述常用的遗传标记基因类型？17、四环素抗性基因Tcr；氨苄青霉素抗性基因Apr；氯霉素抗性基因Cmr；卡那霉素抗性基因Kanr；半乳糖苷酶基因lacZ；葡萄糖苷酸酶基因GUS；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。18、请画图阐明ds-DNA的三种结构缺口、切口和断口19、简述II型限制性内切酶的基本特性19、识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构20、 载体应具备哪些条件？21、 简述为什么噬菌体或病毒可以被开发成为基因工程载体？21、这主要是由于噬菌体或病毒具有被开发成为基因工程载体的特性：一方面其高效率的感

39、染性能使外源基因高效导入受体细胞；另一方面其自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。22、 Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?22、PCR用双引物，体内复制用单引物。24、cDNA克隆与基因组克隆有何不同?24、基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。25、简述基因工程的主要内容或步骤？25、概括起来，基因工程应包括如下几个主要的内容或步骤： 1）、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2）、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到载体分子上，形成重组DNA分子。3）、将

40、重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增殖。4）、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组分子的受体细胞克隆。5）、从这些筛选出的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6）、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。26、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种办法克隆该基因？26、可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。28、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采

41、取什么措施? 为什么?28、注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。29、简述M13噬菌体的生物结构？29、1、M13噬菌体的外型呈丝状；2、M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成；3、M13 DNA全长6407个核苷酸；4、M13 DNA上至少有10个基因；5、M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长。32、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?32、化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连

42、接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。33、影响限制性内切酶活性的因素有哪些？33、影响限制性内切酶活性的因素有：DNA样品的纯度；DNA样品的甲基化程度；核酸内切酶的缓冲液性质；酶切消化反应的温度；DNA的分子结构。34、粘性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。34、粘性末端连接法不足之处有：（1）载体易自身环化；（2）若是用同一种限制性内切核酸酶产生的粘性末端连接又不易定向克隆；（3）难插入特定的基因；（4）再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化

43、，载体也有成环的倾向；（5）用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。35、在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?35、回文序列是：5-CATATG-3，36、双脱氧法测序的基本原理是什么？36、双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2和3碳上都没有了羟基基团，而在天然分子中糖环的3碳上有一个羟基。在DNA复制中，新掺入的碱基按配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的5 -P同生长链的前一个核苷酸的3羟基连接。但是，若进入的核苷酸是双脱氧的，则由于3没有羟基而影

44、响下一个磷酸二酯键的形成，使DNA的复制终止。37、选择克隆载体要参考哪些重要参数？37、1）实验对象 ；2）实验性质；3）载体容量；4）合适克隆位点；5）载体的稳定性；6）载体DNA制备的难易；7）外源基因表达产物产量、产物特点等38、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？38、化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。39、什么叫穿梭载体？39、含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复

45、制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。40、在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?40、这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故41、作为基因工程操作的受体细胞应初步具备哪些条件？41、1、限制性缺陷型；2、重组整合缺陷型；3、具有较高的转化效率；4、具有与载体选择标记互补的表型；5、感染寄生缺陷型42、为了提高重组率可以采取哪些方法？42、答：1）、提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1；2）、载体

46、DNA分子在连接前先除去磷酸基团；3）、加装同聚尾末端：44、蓝白斑筛选为什么也会有假阳性？44、-半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或肽的互补性。如果插入的外源DNA引起肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。45、简并引物设计的一般原则是什么？45、（1）选择保守区设计简并引物；（2）选择简并性低的氨基酸密码区设计引物；（3）注意密码的偏爱性；（4）使用尽可能短的引物，以降低简并性，最短可用15-20个碱基；（5）由于Taq DNA聚合酶在PCR扩增时容易参入错误碱基。所以设计的引物，其3端尽量使用具有简并密码的氨基酸。46、某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?46、离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。55、列举质粒载体必须具备的4个基本特性。55、(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。58、