病原性球菌.doc

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流病原性球菌学习要点： 掌握：葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、淋病奈瑟菌的生物学特性、致病性及微生物检验。 熟悉：脑膜炎奈瑟菌生物学性状、致病性及微生物检验。 了解：微球菌属的生物学特性及微生物检验。一、葡萄球菌属 1生物学特性 (1)形态染色：球形或略呈椭圆形，典型的葡萄球菌排列成葡萄串状，无鞭毛，无芽胞，革兰染色为阳性。 (2)培养特性：营养要求不高，在普通基础培养基上生长良好，兼性厌氧或需氧，最适生长温度为37，最适pH值为7.4，与普通平板上可形成圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落，菌落因菌种不同而呈现金黄色、白色或柠檬色，色素为脂

2、溶性。血平板上，致病菌株可形成溶血现象。 (3)生化反应：触酶阳性，多数菌株能够分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气，致病菌株能分解甘露醇。 (4)抗原结构：主要有葡萄球菌A蛋白(SPA)，荚膜抗原及多糖抗原。 (5)抵抗力：在无芽胞的细菌中抵抗力最强。对青霉素等抗生素敏感。但是耐药菌株逐年增多，已成为医院内感染最常见的致病菌。 (6)分类：根据色素、生化反应等表型的不同，葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌3种。 2临床特征 (1)致病物质：凝固酶、耐热核酸酶等。凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。毒素包括葡萄球菌溶素，杀白细胞素，肠毒素，表皮剥脱毒素，毒性休克综合

3、征毒素-1(TSST-1)。 (2)所致疾病：有侵袭性和毒素性两种类型。侵袭性疾病主要引起化脓性炎症，是葡萄球菌引起的最常见感染。如局部感染的疖、痈、毛囊炎等皮肤及肺炎等内脏器官感染；全身感染的败血症、脓毒血症等。毒素性疾病由葡萄球菌产生的有关外毒素引起，主要有食物中毒假膜性肠炎烫伤样皮肤综合征毒性休克综合征。 (3)免疫性：人类对葡萄球菌有一定的天然免疫力。病愈后免疫力不牢固。 3微生物检验 (1)标本采集：不同病型采集不同标本。化脓性病灶采集脓汁、渗出液；疑为败血症采集血液；脑膜炎采集脑脊液；食物中毒采集病人呕吐物、可疑食物和粪便等，采集时避免病灶周围正常菌群污染。 (2)检验程序及方法：

4、 1)直接涂片镜检：无菌体液标本经染色直接显微镜镜检后，发现有革兰阳性球菌，可做出“查见类似葡萄球菌属革兰阳性球菌”的初步报告。 2)分离培养和鉴定：不同标本经处理后接种血琼脂平板。经37孵育1824h，观察菌落形态，致病葡萄球菌有溶血现象。挑选可疑菌落进一步作形态、生化等方面的鉴定。鉴定试验方法及要点如下： 血浆凝固酶试验，鉴定致病性葡萄球菌； 耐热核酸酶试验，用于检测金黄色葡萄球菌产生的耐热核酸酶； 甘露醇发酵试验，金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇，该试验为阳性； SPA的检测，是鉴定金黄色葡萄球菌的指标之一； 触酶试验，葡萄球菌该试验阴性，以区别于链球菌； 肠毒素的测定，将食物中毒病人的呕吐物

5、或剩余物接种于肉汤管中，孵育后取上清液注射至68周龄的幼猫腹腔，若于4h内发生呕吐、腹泻、体温升高、死亡等现象，提示有肠毒素存在。二、链球菌属 1生物学性状 (1)形态与染色：球形或椭圆形，其中链球菌呈链状排列，革兰染色阳性，无鞭毛，无芽胞。 (2)培养特性：营养要求较高，在血琼脂平板上可形成灰白色、圆形细小菌落，不同群链球菌可出现不同溶血现象，即溶血环，溶血环及不溶血。 (3)生化反应：触酶阴性，一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，这两个特性可用来鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌。 (4)抗原结构：主要有蛋白质抗原，多糖抗原，核蛋白抗原。其中M蛋白抗原与致病性有关，多糖抗原又称为C抗原，根据C抗原

6、不同，将链球菌分为20个群，核蛋白抗原无特异性。 (5)分类：按链球菌细胞壁中多糖抗原的不同，将其分为20个血清群(AH，KV)，对人致病的链球菌约90属于A群，即化脓性链球菌。 (6)抵抗力：不强，对常用消毒剂抗菌药物均敏感。青霉素为首选治疗药物，极少发现耐青霉素的菌株。 2临床特征 (1)致病物质：A群链球菌致病力最强，有较强的侵袭力，是最常见的致病性链球菌。主要有链球菌溶血素：分为链球菌溶血素O(SLO)和链球菌溶血素S(SLS)两种。致热外毒素。侵袭性物质：主要包括脂磷壁酸、纤维黏连蛋白结合蛋白、M蛋白等黏附素以及透明质酸酶、链激酶、链道酶等侵袭性酶。 (2)所致疾病及临床表现：A群链

7、球菌引起的疾病约占人类链球菌感染的90，可引起化脓性、中毒性和超敏反应性三类疾病。化脓性炎症猩红热链球菌性超敏反应性疾病。 (3)免疫性：人体感染链球菌后血清中可出现多种抗体，但因链球菌的型别多，各型间无交叉免疫力，故常反复感染。 3微生物检验 (1)标本采集：根据不同疾病的特点取不同标本。 (2)检验程序及方法： 1)直接涂片镜检：无污染标本经直接涂片革兰染色后镜检，发现有典型的链状排列革兰阳性球菌时，可初步报告。 2)分离培养和鉴定：采用血琼脂平板培养有助于识别链球菌的溶血特性和鉴定，在5C02环境下，经37孵育24h，观察菌落性状，取可疑菌落做进一步鉴定。主要鉴定试验方法及要点如下： 杆

8、菌肽试验敏感试验，出现抑菌环者即可初步鉴定为A群链球菌。 Optochin敏感试验，抑菌环14mm为敏感，肺炎链球菌抑菌环为敏感，其他链球菌不出现或抑菌环14mm，本试验较胆盐溶菌试验鉴别价值更可靠。 胆盐溶菌试验，肺炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性。 血清学鉴定试验，目前应用较普遍的是商品化试剂盒STREPTEX，它主要用于检测链球菌群的特异性抗原，出现凝集者为阳性。 抗SLO试验，常用于风湿性关节炎、急性肾小球肾炎的辅助诊断。三、肺炎链球菌 1生物学特性：为革兰阳性球菌，呈矛尖状，成双排列，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。营养要求较高，兼性厌氧菌，可形成中心下陷的脐窝状的菌落，有自溶现象。可分解多种

9、糖类，产酸不产气，多数菌株分解菊糖，胆汁溶解试验阳性，Optochin敏感试验阳性，可作为肺炎链球菌与草绿色链球菌的鉴别。其抗原成分包括荚膜多糖，菌体多糖，M蛋白。抵抗力弱，有荚膜的抵抗力强，对一般消毒剂敏感。对青霉素、红霉素敏感。 2临床特征：肺炎链球菌是一种条件致病菌，可以引起大叶性肺炎，其次是支气管炎，可继发胸膜炎、脓胸，还可引起中耳炎、乳突炎和脑膜炎。 3微生物检验 (1)标本的采集：根据病种采集不同的标本。 (2)检验程序及方法： 1）直接涂片检查，除血液标本，其他标本均可做直接涂片检查。如见革兰阳性矛尖状双球菌，周围有较宽的透明区，经荚膜染色确认后可初诊，并报告“找到肺炎链球菌”。

10、 2）分离培养，血液、脑脊液增菌培养后，呈均匀浑浊，且有绿色荧光。血液、脑脊液增菌后，脓汁或痰标本直接接种于血琼脂，置510CO2环境中培养后观察菌落，并取可疑菌落做进一步菊糖发酵实训，胆盐溶菌试验和Optochin敏感试验。 3）动物实训，小白鼠对肺炎链球菌极为敏感，通常在接种后1236h，因败血症而死亡。 4）荚膜肿胀试验：将接种待检菌的小白鼠腹腔液置于玻片上，混入不稀释的抗荚膜抗原的免疫血清，加少量碱性美蓝染色液后，覆盖玻片，用油镜检查，如发现荚膜出现肿胀为阳性。四、肠球菌属 1生物学特性：肠球菌为G+，呈单个、成双或短链状排列，无芽胞，无荚膜，营养要求较高，在血平板上可形成灰白色、不透

11、明、表面光滑、圆形菌落，并伴有或不溶血现象。能在高盐、高碱条件(pH96)，高胆汁(40)培养基上和1045C的环境下生长。触酶阴性，胆汁七叶苷水解、万古霉素敏感性及吡咯烷基芳基酰胺酶均为阳性。 2临床特征：肠球菌所致的感染中最常见为尿路感染，而其中绝大部分为院内感染，亦是引起老年人和严重基础疾病患者败血症的常见病原菌。近年来肠球菌耐药菌株及其所致的感染率增加。 3微生物检验 (1)标本的采集：根据病种的不同，可采集尿液、血液及脓性分泌物等标本。 (2)检验程序及方法： 1)直接涂片：可见单个、成双或短链状排列的卵圆形革兰阳性球菌。 2)分离培养：用血平板或选择性培养基，如叠氮胆汁七叶苷琼脂进

12、行分离培养，该培养基可抑制革兰阴性杆菌的生长，而长出的肠球菌菌落为黑色，便于识别。 3)鉴定：主要试验有 PYR试验。本法是一种快速筛选鉴定试验。用于鉴定能产生吡咯烷基芳基酰胺酶的细菌，如肠球菌、链球菌属中的化脓性链球菌、草绿色气球菌和某些凝固酶阴性葡萄球菌等。 胆汁一七叶苷试验。D群链球菌和肠球菌能在含有胆盐的培养基中水解七叶苷，其生成物与铁离子反应生成黑色化合物，97的肠球菌在24h培养后呈阳性反应，72h后100为阳性。但本法不能区别肠球菌和非肠球菌，进一步鉴定需做盐耐受试验。 盐耐受试验。肠球菌能在含6.5NaCl的心浸液肉汤中生长，本法结合胆汁-七叶苷试验可鉴定肠球菌。五、奈瑟菌属

13、1脑膜炎奈瑟菌 (1)生物学特性 形态与染色：为革兰阴性双球菌，菌体呈肾形，成对排列，新分离的菌株有荚膜和菌毛，无芽胞，无鞭毛。 培养特性：营养要求高，最适温度为37C，最适pH为7.47.6。在巧克力平板上菌落为蓝灰色、半透明、光滑、湿润、扁平、边缘整齐呈露滴状；在血平板上菌落不溶血，无色素；卵黄双抗(EPV)培养基菌落为无色，较大且光滑、湿润、扁平，边缘整齐等。 生化反应：绝大多数菌株能分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气(因淋病奈瑟菌不分解麦芽糖，借此与之鉴别)。 抗原及分型：根据群特异性荚膜多糖抗原不同，将该菌分为13个血清群，其中H、I、K血清群是由我国发现的，我国流行的菌株以A群为主。

14、抵抗力：抵抗力弱，对干燥、热、寒冷、紫外线、消毒剂等均十分敏感。对磺胺类、青霉素、链霉素均很敏感。 (2)临床特征 致病物质：主要有内毒素、荚膜和菌毛。 所致疾病及临床表现：本菌主要引起流行性脑脊髓膜炎，传染源是病人和带菌者，经飞沫传播，主要临床症状为脑膜刺激征，严重者可死亡，病死率极高。 免疫性：病后可产生群特异性抗体，但不持久。 (3)微生物检验 1)标本采集：根据临床病程采集不同标本。采集的标本应立即送检或用血平板进行床旁接种后立即孵育。 2)检验程序及方法： 直接涂片检查：取脑脊液离心后沉淀物涂片或刺破瘀斑血印片，干燥固定后革兰染色或美蓝染色镜检，若发现中性粒细胞内(或胞外)革兰阴性双

15、球菌，呈肾形成对排列，可初步报告。 分离培养：增菌后接种于巧克力琼脂或EPV琼脂，置510CO2环境中培养后观察菌落，取可疑菌落涂片，并进一步根据相应的生化反应等试验予以鉴定。 鉴定：通过直接凝集试验鉴定血清型别，及氧化酶、糖类发酵和触酶试验等生化反应作出鉴定。总之，如直接镜检形态为革兰染色阴性双球菌时可初步报告，经分离培养后见菌落特征典型、分解葡萄糖、麦芽糖、产生少量酸，氧化酶试验阳性、血清凝集试验阳性，即可报告“检出脑膜炎奈瑟菌”。 2淋病奈瑟菌 (1)生物学特性：本菌的形态常呈球形或肾形，成对排列，形似咖啡豆，革兰阴性。新分离的菌株可有荚膜和菌毛，无芽胞和鞭毛。需氧生长，营养要求较高，只

16、能在巧克力琼脂培养基中生长，初次分离时须在510CO2环境下培养，可形成灰白色的菌落。本菌只分解葡萄糖，产酸不产气，氧化酶和触酶试验阳性。抵抗力弱，对消毒剂敏感，对青霉素、磺胺等抗生素敏感，但是耐药菌株逐渐增多。 (2)临床特征：致病物质有菌毛、外膜蛋白、IgAl蛋白水解酶、LPS等，主要引起人类淋病，是我国目前流行的发病率最高的性病，主要通过性接触而感染泌尿生殖道、口咽部和肛门直肠的黏膜，并可播散至全身。若母亲患有淋病时，婴儿出生时可感染导致淋菌性结膜炎。病后虽产生相应的细胞免疫和体液免疫，但免疫力弱，不足以保护再感染。 (3)微生物检验 1)标本采集：主要取泌尿生殖道脓性分泌物或眼结膜分泌

17、物，全身淋病可取血液，采集后立即送检。 2)检验程序及方法： 直接涂片检查：革兰染色后镜检若发现中性粒细胞内有革兰阴性双球菌，结合症状可初诊。 分离培养：细菌培养仍是目前世界卫生组织推荐的筛选淋病病人的惟一方法。常用的分离培养基为巧克力平板。接种后置于510CO。环境中培养后观察菌落，取可疑菌落进行涂片镜检，并作生化试验予以鉴定。病原性球菌的检查 实验目的： 1了解病原性球菌的检查程序。 2掌握细菌涂抹标本制备和革兰氏染色法。 3掌握病原性球菌的形态和分离培养法。 实验材料： 病原性球菌的形态、脓汁标本、革兰氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、

18、标记笔。 实验内容： 一、病原性球菌的检查程序 病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。 1、标本采集 （1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内。 （2）痰液：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管。 （3）咽部分泌物：嘱病人张开口，用压舌板轻压舌根部，以无菌棉拭从鼻咽部位擦拭取材，然后将其放入无菌试管。 （4）血液：高热、败血症患者作血液检样时，最好在发热时，抗菌药物治疗前采取，这时培养阳性率最高。取血35毫升，立即以无菌手续注入3050毫升（使血与培养基之比约等于110）的葡萄糖酚红肉汤增菌培

19、养基中。 （5）脑脊液：对疑患流脑的患者作腰椎穿刺取脑脊液（CSF），脑脊液取出后应盛于无菌容器内，立即送检。 （6）尿道、阴道分泌物：对淋病可疑患者，男性可从尿道取材，取材时应进入尿道12cm，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转12分钟拿出，取材应立即送检，不可放置冰箱。 2、分离与鉴定 待检标本可直接作涂片染色检查鉴定，必要时可作分离培养及生化反应，致病性鉴定。常见致病性球菌的检查程序如下。二、涂片染色镜检 （一）涂抹标本制备方法：1、涂片：取洁净的载玻片一张，用蜡笔标记，接种环灭菌后，以接种环取浓汁标本1-2环，置于玻片的中央，涂成直径

20、约1cm的均匀薄膜涂片。如用固体培养物，须先加生理盐水，再将细菌少许与生理盐水混匀。2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检测。3、固定：涂片干燥后，手持玻片一端（涂膜面向上）在酒精灯上快速地来回通过三次，共约23秒钟，注意温度不可太高，以玻片涂膜的反面触及皮肤觉烫而尚能忍受为度。固定的目的一是杀死细菌；二是使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；三是使菌体蛋白变性易着色（见图142）（二）革兰氏染色法 革半氏染色法（Gramstain）是丹麦细菌学家革兰（Christain Gra

21、m）于1884年发明的，至今已逾百年，但仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。其基本过程是标本经固定后，先用结晶紫初染，再用革兰氏碘液媒染，然后用95%酒精脱色，最后用石炭酸复红稀释液复染。此法可将细菌染成两大类：不被酒精脱色仍保留紫色的为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色的为革兰氏阴性菌。 1、原理：革兰氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说： 等电学说：革兰氏阳性菌等电点（Ph23）比革兰氏阴性菌（Ph45）低，一般染色时染液的酸碱度在Ph7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 通透性学说：革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚

22、糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰氏阴性细菌细胞壁疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物容易被乙醇溶解而脱出。 化学学说：革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它和染料-媒染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。 2、革兰氏染色液的配制：结晶紫染液：结晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml中，制成结晶紫酒精饱和液。取出此饱和液20ml与1%草酸铵水溶液80ml混匀。 碘液：先将碘化钾2.0溶于约2ml蒸馏水中，再

23、加碘片1.0g，略加振摇，待碘片完全溶解后，再加蒸馏水至总量为300ml。 稀释石炭酸复红染液：取碱性复红10.0g或碱性复红（新）4.0g溶于95%酒精100ml中，配成碱性复红酒精饱和液；取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混匀，配成石炭酸复红原液；取此原液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。 3方法： 初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用一分钟后，用细流水轻轻冲洗。 媒染：滴加媒染剂碘液数滴，室温作用一分钟，用细流水冲洗。 脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒

24、精无色或稍淡紫色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。 复染：滴加稀释石炭酸复红液复染约30秒钟后用细流水冲洗。 镜检：标本染色后，凉干，滴香柏油，用油镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。 三、平板划线接种法（分离培养法）见细菌分离与培养。实验六 开放实验-病原性球菌的分离鉴定病原性球菌主要包括3个属，即葡萄球菌属、链球菌属、和奈瑟球菌属。目的要求1、掌握葡萄球菌属的分离培养与鉴定方法 、菌落特点、菌体形态及染色性2、掌握链球菌属的分离培养与鉴定方法 、菌落特点、菌体形态及染色性材料浓汁标本（痰、分泌物、穿刺物）或血、尿、胆汁标本等 革兰染液，血液培养基，兔血浆、生理盐水

25、等 显微镜 恒温培养箱 超净工作台方法及步骤 按以下图表进行操作：1、观察菌落特点：脓汁标本在血平板上经过24小时的培养，已经长出菌落，首先2、观察菌落的特点： 菌落的形态； 光滑程度； 色素的产生情况； 细菌的溶血情况。3、形态学鉴定：革兰染色，观察细菌的染色性状和排列特点。结果判断菌落特点：形态；色素；溶血；革兰染色的特点：判断形态，排列和染色；根据溶血判断链球菌的种类；根据生化反应区别肺炎双球菌和甲链。如染色后为G+菌葡萄串状排列，首先观察菌落特点，包括色素颜色，色素性质等；溶血情况，是否有溶血环；进一步鉴定需做 血浆凝固酶实验，耐热核酸酶实验及甘露醇发酵实验。由此判断是否为金黄色葡萄球

26、菌。实验十一 病原性球菌 病原性球菌中常见的细菌有革兰阳性的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌及革兰阴性的脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。不同的细菌，它们的菌体形态及排列情况各不相同，有些细菌还可以有荚膜，有些细菌还可以产生颜色各异的色素。在含血琼脂培养基上，不同的细菌的菌落也各不相同，不同的细菌还可以产生大小、颜色不同的溶血环。以上的这些均可以作为病原性球菌鉴别的依据。 一、常见病原性球菌的形态学和培养特性观察 【目的】 认识病原性球菌的形态、染色性及培养特性。 【内容】 1、观察革兰阳性的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌及革兰阴性的脑膜炎奈瑟菌的革兰染色示教片在油镜下的形态和排列情况。 2、观察肺炎链球

27、菌经过荚膜染色后，在油镜下荚膜的形态及位置。 3、观察金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌及脑膜炎奈瑟菌在血琼脂平板培养基上的菌落特征。 【材料】 1、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌及革兰阴性的脑膜炎奈瑟菌的革兰染色示教片。 2、肺炎球菌荚膜染色染色示教片。 3、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌及脑膜炎奈瑟菌血琼脂平板。 【方法】 1、油镜下观察葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌革兰染色示教片，注意它们的染色特性、形态和排列，并注意观察脑膜炎奈瑟菌在中性粒细胞内外的情况和肺炎球菌的荚膜（荚膜染色）。 2、菌落特性观察：观察金黄色葡萄球

28、菌、表皮葡萄球菌在血琼脂平板上的菌落特征，重点观察菌落的颜色及溶血性。观察甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌在血琼脂平板上的菌落特征，重点观察溶血性。 【结果】 1、油镜下形态： （1）葡萄球菌为直径0.5m1.5m的圆形或卵圆形形态，排列呈葡萄串状，也可单独散在排列，革兰染色阳性。 （2）链球菌和肺炎球菌为直径0.5m1.0m卵圆形革兰阳性球菌，肺炎链球菌多成双排列，尖端向外，宽端相对。其他链球菌多排列成链状，也可单独散在排列。 （3）脑膜炎奈瑟菌为革兰阴性球菌，直径为0.6m0.8m，呈肾形或豆形，成双排列，平坦面相对。 （4）肺炎球菌荚膜染色后，菌体与背景为紫色，荚膜为无色或

29、淡蓝色，围绕在菌体周围。如果有2个或以上菌体连在一起，则荚膜围绕在细菌集团的周围。 2、菌落特征： （1）葡萄球菌在血琼脂平板培养18h24h后，菌落呈2mm3mm直径，金黄色、白色或柠檬色等不透明的、圆形凸起、边沿整齐、表面光滑的菌落；金黄色葡萄球菌的菌落周围有完全透明的溶血环。 （2）链球菌和肺炎链球菌在羊血琼脂平板培养基上培养18h24h后，菌落为0.5mm2mm直径，圆形凸起，半透明，表面光滑，边缘整齐的菌落。甲型溶血性链球菌的菌落周围可出现较窄的草绿色溶血环（溶血），乙型溶血性链球菌的菌落周围可出现较宽的完全透明的溶血环（溶血），丙型链球菌无溶血环。肺炎链球菌的溶血环和甲型溶血性链球

30、菌一样为溶血，但是该菌可以产生自溶酶，故延长培养时间，菌落中央可出现脐凹。 （3）脑膜炎奈瑟菌在血琼脂平板培养基上的菌落为直径1mm2mm，光滑、半透明、湿润菌落。 二、血浆凝固酶试验 【目的】 了解血浆凝固酶试验方法和意义。 【原理】 多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而致病性较弱或非致病菌一般不产生。所以血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌致病性强弱的指标之一。葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种是结合在细菌的细胞壁上的结合型血浆凝固酶，另一种是游离型血浆凝固酶，产生后分泌到菌体外。两种血浆凝固酶均可以使血浆中可溶的纤维蛋白原转变成为固态的纤维蛋白，从而使血浆凝固。结合型血浆凝固酶用玻片法检测，

31、游离型血浆凝固酶用试管法检测。 【材料】 1、菌种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在普通琼脂培养基上的培养物（或18h24h的肉汤培养物）。 2、兔（或人）血浆、生理盐水等。 【方法】 1、玻片法：检测结合型凝固酶。 （1）在玻片的左右两端各加1滴无菌生理盐水（或蒸馏水）。 （2）用接种环分别取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌落，置于生理盐水（或蒸馏水）中，制成均匀的浓菌悬液，观察有无自凝现象。 （3）在细菌悬液内加入兔血浆一接种环，混匀，并轻轻摇动玻片。观察结果，肉眼见白色凝块沉淀出现为凝集。 2、试管法：可以检测结合型凝固酶和游离型凝固酶。 （1）用生理盐水将血浆4倍稀释，在2支无菌试管内各加

32、入0.5m1。 （2）然后分别挑取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌3接种环，置于稀释血浆中，仔细研磨，制成均匀的浓菌悬液。 （3）置37水浴，1h4h观察结果，注意不要震动或摇动，以免破坏凝固的血浆，凝固者为阳性。若阴性可继续37孵育24h再观察，仍不凝者为阴性。试验应同时作阳性、阴性对照。 【结果】 1、玻片法： （1）20秒钟内显著凝集，为阳性。 （2）20s1min后才出现颗粒或凝块为迟缓阳性。 （3）1min后出现颗粒为可疑，应重复试验；若结果相同，需通过试管试验法确定。 （4）菌悬液保持均匀无变化为阴性，在报告结果以前，需进行试管试验法来确定。 2、试管法： （1）出现凝块或明显的纤维蛋

33、白丝状物为阳性。 （2）悬液保持均匀，不出现凝块，与未接种一样为阴性。 【思考题】结合型和游离型血浆凝固酶检测方法是什么，如何观察结果？ 三、透明质酸酶试验 【目的】 了解链球菌的致病物质之一：透明质酸酶，以及它的致病作用和特点。 【原理】 透明质酸是链球菌产生的致病物质之一，它可以降解细胞间质的透明质酸基质。使组织变疏松，有利于感染的扩散。 【材料】 家兔一只，链球菌血清肉汤24h48h的培养物一支（也可以用商品化的透明质酸酶代替），未接种细菌的无菌肉汤一支，美兰溶液，无菌注射器一支。 【方法】 取家兔一只，剃去两侧背部的毛，约10cm10cm大小，常规消毒。将链球菌肉汤培养物经3000rp

34、m，离心30min，吸取1ml上清液于无菌试管中，加入美兰溶液1ml，混匀后用无菌注射器吸取0.2ml注射入家兔的皮内，呈一皮丘；另一侧注射等量美兰和未接种细菌的无菌肉汤的混合液0.2ml，作为对照。注射后30min60min内观察结果。 【结果】 比较两侧美兰溶液在家兔皮内扩散的范围，含透明质酸酶的一侧的皮丘直径应大于对照侧2倍以上。 【思考题】 联系本试验谈谈为什么链球菌感染容易扩散，而葡萄球菌感染易局限化？ 四、抗“O”试验 【目的】 了解测定抗链球菌溶血素“O”抗体（ASO）的实验方法、原理及临床意义。 【原理】 链球菌溶血素“O”是溶血性链球菌的代谢产物之一。具有溶血作用和抗原性。在

35、溶血性链球菌感染后23周，体内便产生抗链球菌溶血素“O”的抗体。本实验基于抗原抗体中和试验的原理，用具有溶血能力的还原型溶血素“O”（因SLO在空气中易被氧化，所以在使用前加入还原剂如盐酸半胱氨酸、亚硫酸铁等，以恢复其活性）检测血清中有无中和抗体（ASO）产生。凡查出病人血清中此抗体效价显著升高，可认为患者近期被溶血性链球菌感染过，还可用于辅助诊断风湿热、肾小球肾炎等疾患。 ASO测定即抗链球菌溶血素“O”的测定，常用方法有溶血法和胶乳凝集法，两法的实验设计不同，但后者方法简便、快捷，使用越来越广泛。胶乳凝集法原理是，ASO高滴度的病人血清被适量的溶血素中和后，ASO还有剩余，这些剩余的抗体即

36、与ASO胶乳试剂反应，出现外观清晰、均匀的凝集颗粒。ASO胶乳试剂系羧化聚苯乙烯胶乳与溶血素“O”共价交联的产物。 【内容】 1、溶血法测定ASO。 2、ASO胶乳凝集试验方法测定ASO。 【材料】 待检血清、链球菌溶血素“O”及还原剂（亚硫酸钠），pH6.5缓冲液 、2%家兔红细胞悬液（或2%人O型红细胞悬液），生理盐水、ASO胶乳试剂一套。 试管、吸管、黑色反应板、水浴箱等。 【方法】 1、溶血法： （1）溶血素“O”的配制： （2）溶血素“O”0.2mL及还原剂(亚硫酸钠)一片置于小试管内，加生理盐水1m1，搅拌混匀后，放置37水浴10min使其还原。取出后，补加生理盐水5.8ml，即可

37、应用。还原型溶血素“O”应在30min内使用，过时失效。溶血素“O”批号不同配制方法有别。 （3）待检血清置56水浴中加热30min灭活，用pH6.5缓冲液配成1：500稀释血清，备用。 （4）按2111操作（用常规试验中的部分稀释度的血清进行实验操作）。 表2111溶血法测定ASO操作程序 单位 ml 12345混匀，37水浴15min，进行下一步1：500待检血清0.5 0.30 0.20 pH6.5缓冲液0.200.250.5 0.75还原型溶血素“O”溶液0.250.250.250.252%红细胞悬液 0.250.250.250.250.25混匀，37水浴45min，进行下一步血清稀释

38、度1：5001：8331：1250对照对照观察结果2、ASO胶乳凝集试验： （1）标本用生理盐水做1：50，1：80，1：100稀释，56灭活30min(或603min)。 在反应板上分别滴加稀释灭活血清以及阳性和阴性控制血清各一滴，再各加溶血素“O”溶液一滴，轻轻摇动2min，使其充分混匀，均匀分布于方格内。 （2）加ASO胶乳试剂一滴，轻轻摇动8min（室温为20），观察结果。 【结果】 1、溶血法： 取出各管，对光观察有无溶血现象，以完全不溶血的血清最高稀释度为该血清的抗链球菌溶血素“O”的效价，正常值在500单位以下。 2、胶乳法： 将反应板平放在实验桌上，有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。判断血清中ASO效价：表2112 血清稀释度ASO滴度1：50（）5001：80（）8331：100（）1000 【思考题】 1、ASO胶乳凝集试验中为什么被测血清应先加入适量的溶血素“O”，然后再加入溶血素“O”胶乳试剂？其原理是什么？ 2、抗O”实验的临床意义有哪些？五 常见病原性球菌检验的一般性程序 【精品文档】第 11 页病原性球菌