最新DNA提取方法和试剂作用详解.doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateDNA提取方法和试剂作用详解DNA提取方法和试剂作用详解1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心

2、后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。2 DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;化学试剂法：用SDS处理细胞;酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除

3、掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。 将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。 另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。DNA提取的几种方法(1).浓盐法A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎

4、液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. （2）.阴离子去污剂法; 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取

5、DNA（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 （4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体

6、积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS. 1.动物来源的DNA的提取1. 1经典提取方法酚抽提法 、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品

7、。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。1.2 玻璃棒缠绕法该 法 用 盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸人TE中过夜，使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高，但简单快速。1.3 血细胞DNA的快速提取法采用 非离子变性剂NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞，提取细胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。这样从血液中

8、分离获得的DNA纯度高，能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween -20同时作用破碎细胞膜，以避免SDS对以后步骤的负面作用。 Ba sun i等 采用了4种常用的从血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 试剂盒法、QlAamp试剂盒法、Tri- PureTM试剂分离提取法以及经典酚抽提法，对通常作抛弃处理的血凝块进行人DNA 及病毒DNA的抽提，发现前两种方法可以迅速高效获得目的DNA，从而建立了由血凝块中提取DNA的方法，扩大了临床检验样本的来源。1. 4 玻璃颗粒吸附法在该 法 中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞，然后加人含有

9、能够与DNA 结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以与DNA 进行结合，一定大小的硅胶颗粒也可以与 DNA进行结合，据此，不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA 的提取方法。 Pichler等2在从抹香鲸(Physeter macrocephalus) 牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法，从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物，此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。 Caldarelli-stefano等3在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DN

10、A时利用小磁珠作为结合核，也获得了理想的纯化 DNA。很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒，Pint。等4就探讨了采用 Gibc。公司的GlassMAX系统，对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法，目前这些试剂盒在临床上广为应用，省时省力。1.5 三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)法由于 常 规 方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握，采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。 TLS是一种较强的表面活性剂，将其直接作用于细胞或组织匀浆，可迅速溶解细胞膜、核膜，而且蛋白质与其结合后即失去对DNA 的结合，进一步的纯化可采用常规方法。1. 6 临床病理标本的DN

11、A提取方法由于 PC R技术不仅可用于基因分离、核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。近年来，PCR技术已广泛应用于病理学研究，尤其对福尔马林固定石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关注的焦点。对于从这些病理标本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，该法虽然效率较高，但费时费力，而且其操作中要求多次离心，增加了样品污染的可能性。近年来很多高效灵敏的方法在实践中得以采用，这些方法通常采用加热或微波法s去除包埋的石蜡，使用Sephadex G- 5。柱色谱或盐析法s7等去除蛋白质。高文涛71等在研究福尔马林固定石蜡包埋组

12、织 DNA提取方法对PCR的影响时，发现在组织切片中加人鳌合树脂(Chelating Resin，亚氨基二乙酸)提取获得的DNA可取得较好的PCR扩增结果。Coombs等s则采用热循环方法，将标本上的蜡融人样品溶液，在酶的作用下进行裂解，然后用Chelex-100进行吸附，离心去蜡，这种方法安全、简便、有效、经济。1.7 盐析法该 法用 饱 和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的DNA质量可以满足PCR模板的要求，但产率相对较低，纯度较差。谭建明等9对上述盐析法进行了改进，即将处理过的样本加人SDS和蛋白酶K后，在56C 消化1h，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并经离心除去，上清直接用乙醇沉淀

13、DNA。该法简化了DNA的抽提步骤，可用于人体各种样本DNA的提取，所获DNA的纯度可以满足各种检测的需要。2 植物来源的DNA提取利用 基 因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组总 DNA的制备，不同植物的核酸结合蛋白的情况各不相同，因而要采取不同的提取方法10。由于植物中次生代谢产物 多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物DNA纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性。因此要从富含多酚和多糖的植物组织中分离获得高质量的基因组 DNA也并非易事11l。目前采用的方法有以下几种。2

14、.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法CTAB 是 一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA和多糖分开，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在该法中使用的聚维酮 (PVP)与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的DNA降解121。王卓伟等13在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVI还能有效地去除多糖。罗志勇等14在研究中对这种方法进行了几点改进: 提高CTAB的浓度;对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中琉基乙醇的含量，同时加人PVP使其与多酚类物质结合形成复合物;增加低盐沉淀缓冲液的量

15、;增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA, Porebski等1s在沉淀粗提 DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5m o卜L-以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等16 对传统的CTAB法进行了优化，创建了一种从新鲜草本植物样本中提取DNA的方法。首先在特制的有96个孔的托盘上种植植物样本，并依照不同样本在托盘中的位置进行编号，然后取适量植物叶子分装在充满提取液的塑料袋中，除去袋中的空气并封口，再用特制的手工匀化器将各袋中的样本混匀，56C孵育 1h后将袋中的液体取出进行离心以及DNA 的沉淀。Xi

16、n等17则采用简易的96孔托盘作为提取时的容器，将多种植物样本经研磨处理后分别放在不同的孔中进行提取，在一天内由一人就可完成上千个样本的DNA提取，为高通量植物基因分析及筛选提供了极大的便利。2.2 SDS法为 了避 免 CTAB法试验步骤多、操作繁琐的不足之处，近年来又提出了利用SDSTris- Cl- EDTA等直接裂解细胞使其释放出DNA的方法。在该法后续的DNA纯化过程中通常采用酚/氯仿处理，但对于植物 DNA纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低DNA的提取效率和纯度。在用该法提取DNA的过程中采用较大的离心力和较长的离心时间，然后用氯仿一异戊醇代替酚来去除变性蛋白质，从而克服了

17、由于酚的掺人及残留对以后酶切带来的困难。用琉基乙醇代替SDS，对大豆DNA分离提取能够更有效地去除蛋白质，而且可以有效防止褐变，获得天然双链高分子量的DNA产物，并且减少了SDS对 PCR、随机扩增多态性DNA技术(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的影响。在对辣椒DNA进行提取时为了提高DNA的产率将待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且针对辣椒叶子中多酚类物质极少的特点将其中的加人PVP的步骤省去，消除了PVP对以后操作的影响.2.3 氯化千法在对称猴桃的基因组DNA 提取过程中选用了氯化节法，与其他方法相比该法的得率较高，其原因可能

18、是氯化节不仅可与植物细胞壁上的多糖经基反应生成醚，而且与细胞液中多糖物质的All基反应，起到破坏糖链的作用，利于DNA的释放和提纯。2.4 高盐低pH法该 法 中 所用的提纯试剂仅为无机盐和异丙醇。通常采用的无机盐为醋酸钾，低pH的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂。与一般氯仿一异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作相比该法操作更方便省时，所需样品量少，适用于濒危植物DNA的提取。2.5 果胶酶法Ste ve n等 2s采用果胶酶对植物细胞破碎后的抽提混合物进行消化处理使与DNA共沉淀的胶状物质分解成小的片段，从而无法与DNA一起沉淀下来，降低了DNA的纯化难度，提高纯化效率。3 微生物来源DNA的提取常规

19、的微 生物DNA提取多是根据某种微生物的具体特点选择合适的方法。在实际的科学研究过程中，很多科学工作者通过实践总结出许多快速实用的提取方法，现择其中比较典型的加以总结。3.1 细菌质粒的提取方法质粒是独立于细菌染色体DNA之外的环状DNA，它能携带外源基因进人细菌进行扩增，或表达外源基因，是基因工程中常用的载体，在DNA重组技术、DNA测序、转基因等方面具有广泛的应用。对于细菌质粒的提取比较经典的方法有:碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。这些方法的选择取决于质粒的大小、细菌菌株的性质等。Keunosky等GE_发展了一种以 Zn+诱导DNA沉淀的方法，在该法中利用

20、一定浓度的ZnCl:溶液使一定体积的细菌菌液质粒DNA大量沉淀，无需多次离心，大大简化了抽提的步骤。近年 来 ，一些生物技术公司，比如Promega公司及Qiagen公司等纷纷推出质粒抽提试剂盒，这些试剂盒多运用树脂材料或硅胶来特异性的吸附质粒DNA，提取过程用时少，效率高。 3.2 真菌DNA提取方法对 真菌 DNA的提取关键是破碎细胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷冻处理增加细胞壁脆性的物理破壁法。在这两种方法中酶解破壁法较为简单，易于操作和控制，而物理破壁法在处理过程中容易造成细胞核的大量破损。在提取获得核酸一蛋白质复合物后，对其中蛋白质的沉淀也多采用传统的氯仿一异戊醇沉淀法或高盐沉淀法。

21、韩利刚等C25用CTA13法直接从丝状真菌的新鲜菌丝中提取DNA，并将所提取的DNA进行 RAPD，得到了较清晰的扩增图谱。Loeffler 等Z6为满足快速灵敏准确的临床检验的需要，利用MagNA Pure LC系统建立了一种实用的快速提取方法，该法自动化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等z7在对真菌进行DNA抽提时采用几个循环的快速制冷、煮沸以破碎真菌细胞壁，并通过Qiagen 公司的QIAquick DNA纯化柱，迅速从极微量的真菌中获得高纯度的DNA大分子。3.3 结核杆菌DNA的提取方法利用 PC R微孔板杂交技术检测临床标本中结核杆菌DNA是诊断结核杆菌感染的一种快速灵敏

22、和特异的方法。从不同的临床标本中获得DNA是检测准确和成功的关键。而不同来源的结核杆菌又分别受到不同来源材料的影响，所以提取方法各不相同。同时由于结核杆菌的细胞壁比较厚不易破碎，一般的微波法、异硫氰酸肌法、冻融法等难以破坏结核杆菌的细胞壁。通常采取的方法有:经典酶一酚一氯仿法，碱一SDS裂解法，碱裂解煮沸法，超声裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。杨正林等28通过对以上几种方法的比较发现玻璃粉一硅吸附法操作简单，假阳性低，适合临床检测使用。3.4 土壤微生物总DNA的提取方法土壤 中 细 菌的含量丰富，种类齐全，从中提取细菌DNA可用于检测不可培养的细菌，跟踪某些目标菌或重组

23、基因在自然环境中的行为，也可用来解释土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随环境的变化。从土壤中提取和纯化DNA是最关键的技术之一。 Courtoi:等29对比了在土壤中直接裂解微生物体、然后提取DNA和先将微生物菌体通过梯度离心与土壤颗粒分开再进行提取的方法，利用PCR技术以及杂交技术检测不同方法获得DNA的种类和纯度，发现前一种方法具有更高的效率，能够提取获得较多微生物物种的 DNA。张瑞福等30采用SDS高盐提取法和透析袋回收法对9种不同来源的土壤进行微生物DNA的提取，与通常采用的对菌体细胞的超声破碎法以及对粗提DNA的微型柱纯化法相比，既保证了一定提取与回收效率，又兼顾了DNA的质量

24、，使DNA在提取和纯化过程中不会受到损伤。4 海洋生物DNA的提取方法海洋 是 地 球上最大的生物资源库，同时由于海水的保护使海洋生物变化很少，物种得到较好的保存，这样就为研究生命现象的基本问题提供了丰富的资料。在利用这些资源探讨诸如生命的起源、生物进化、生物与环境的关系、改造海洋生物以为人类服务(如生产某种药物)时离不开对生物核酸的研究。对于海洋来源的动物、植物、微生物由于其不同于陆生生物的组织和细胞结构特点往往采用不同的DNA提取方法。张海 琪 等 31_在对不同方法保存的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肌肉样品基因组 DNA进行提取时发现，经福尔马林、乙醇及含有EDTA

25、的乙醇保存的样品可以同鲜活样品和冷冻样品一样获得基因组DNA，但相比之下采用乙醇作为固定剂更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，获得了满意的效果。杨文新等32利用75%的乙醇固定鲍鱼(Haliotis discus)样本并进行DNA的提取，证明用乙醇固定海洋动物组织是一种切实可行的方法，材料处理后可同步提取，增加了实验的同步性、可比性，适用于大量样本的提取。由于组织中含有许多DNA酶，绝大多数DNA酶需要一个二价阳离子作为辅助因子，因此采用含适量EDTA的乙醇固定剂是野外标本采集和运输的一种更简便有效的方法。 韩兵 社 等 33:针对传统的有机溶剂提取工艺进行改进，应用多种萃取液体系从废

26、弃物鱿鱼肝脏中提取核酸，与原工艺相比，核酸提取产量提高30%-60%，整体工艺得到简化，而且避免了有机物的残留。 赤 潮 是 在特定的环境前提条件下，海水中的某些浮游生物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象，对海洋渔业、水产资源以及人类的健康造成很大的威胁。发生赤潮的生物类型主要为藻类，铜绿微囊藻(Microcytis aeruginosa) 是造成赤潮的藻类之一。陆源等34用乙醇乙醚混合液对纯化的铜绿微囊藻作预处理，破坏了其胶质鞘，从而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其细胞壁，细胞内的DNA释放完全，提高了总DNA的得率。通过提取获得的DNA有助于开展对

27、有害藻类的研究，为防范赤潮提供依据。在对 紫 菜 (Porphyras p.)进行DNA提取时，郭宝太等35先用海螺酶处理样品制备紫菜体细胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解细胞提取总DNA，再用Wizard DNA clean-up;树脂进行纯化。经海螺酶处理的紫菜细胞解决了通常采用的液氮破碎细胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有严重的多糖污染等难题。但这种方法对植物组织需求量较多，不适于个体体积小的紫菜。刘必谦等36采用美国Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ- 10小量柱式基因组DNA提取试剂盒对个体体积较小的圆紫菜(P

28、orphyra suborbiculato )、铁钉菜(Ishige okamurae)等进行DNA 的提取，获得高纯度的基因组DNA，完全能满足酶切片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技术的需要。陈子 桂 等371以海洋尾丝虫(Uronema marinum)为材料，针对纤毛虫难以建立培养以及个体丰度不高等特点，就微量条件下提取DNA的方法进行了探讨，成功地获得了活体直接提取、活体酚/氯仿抽提、固定标本直接提取以及固定标本酚/氯仿抽提等四种简便有效的微量DNA提取方法，解决了纤毛虫微量DNA提取的困难。综合 DN A的提取

29、方法，虽然不同生物 DNA的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴。随着生物技术的飞速发展，对这一技术的经验总结将会越来越多，一些生物领域新的DNA提取方法也将逐渐固定下来，更为简捷、高效的方法也必将出现，为基因工程提供更高纯度的DNA.1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。【实验原理】DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的

30、DNA分子。【仪器、材料、试剂】（一）仪器1高速离心机2烘箱3冰箱4水浴锅5微量移液器6高压灭菌锅（二）材料1生理盐水2十二烷基硫酸钠（SDS）3三羟甲基氨基甲烷（Tris）4乙二胺四乙酸（EDTA）5饱和酚6氯仿7异戊醇8无水乙醇975%乙醇10蛋白酶K11RNase酶12手术剪刀、镊子、吸水纸13微量取液器14研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔（三）试剂配制1TrisHCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输

31、液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2生理盐水: 0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。3EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：将9.08g的EDTANa22H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTANa22H2O。4TES缓冲液（释放DNA） 100ml配制方法：将0.5844g的5 mol/lNaC

32、l溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。510% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4保存备用。6蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。7RNA酶 （降解RNA）配制方法：将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的TrisCL（PH

33、7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于20。8氯仿：异戊醇=24：1 100ml按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4保存备用。9TE缓冲液（溶解DNA） PH8.0 50ml配制方法：将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。【实验步骤】1组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组

34、织，放入1.5ml离心管中，剪碎。2加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56C保温4-6h，每2h摇1次。3放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。4加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。5加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。6加入2.5倍体积的-20C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。712000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。8-20C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55C干燥DNA。9加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20C保存备用。【注意事项】1抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。2取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。3乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。4离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。-