微生物学实验.doc

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1、实验一 实验室和人体表面微生物的检查一 实验目的1 证明实验室环境与体表存在微生物2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型3 体会无菌操作的重要性二 实验原理平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。三、器材1、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂平板2、仪器或其他用具 无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，

2、试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。四、操作步骤1、写标签任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。2、实验室细菌检查（1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。（2）实验台 用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。取棉签 左手拿含有棉

3、签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。取样 将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。接种 在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将

4、试管放回试管架。划线 另取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。 闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，从上向下来回划线至12处

5、。烧灼接种环，转动平板，划最后14，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。3、人体细菌的检查（1）手指（洗手前与洗手后）（2）鼻腔 按照实验台检查法的步骤，取出棉签，并将其弄湿。用湿棉签在鼻腔内滚动数次，按实验台检查法的步骤和接种与划线，然后盖上皿盖。4、将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37培养箱，培养1-2d5、结果记录方法（1）菌落计数 在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数，不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。菌落特征：大小、颜

6、色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘。菌落特征描写方法如下：大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。干湿情况 干燥、湿润、粘稠。形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。透明程度 透明、半透明、不透明。边缘 整齐、不整齐。五、实验报告P13：结果1、思考题3、41 比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？2 人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？3 通过本次实验，在

7、防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？六、实验总结实验二 细菌简单染色和普通光学显微油镜的使用和细菌形态观察一、目的要求1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。2熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。3学习并掌握油镜的原理和使用方法。三、油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，4045）和油镜（1.8 mm，95100）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大100

8、02 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定

9、的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NAnsin 式中 NA=数值孔径；n=介质折射率；=最大入射角的半数，即镜口角的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上

10、是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：MBCmethylene blue+chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。三、器材 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，擦镜纸，生理盐水；结晶紫染色液，碱性复红染色液；金黄色葡萄球菌，大肠杆菌。四、操作步骤1、涂片 取

11、两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作（参照实验一），分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。2、干燥 于室温中自然干燥。3、固定 涂片面向上，于火焰上通过23次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。4、染色 放标本于水平位置，分别滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。结晶紫染色液染23分钟，石炭酸复红染色液约染12分钟。5、水洗 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端

12、流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。6、镜检（1）、低倍镜观察（2）、高倍镜观察（3）、油镜观察用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。用同样的

13、方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。六、实验报告1结果：绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。（注明物镜放大倍数和总放大率）2思考题P18 思考题1、P28 思考题2、3（1）根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？（2）制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？（3）

14、在明视野显微镜下，观察细菌形态时，你认为用染色标本好，还是用未染色的活标本好，为什么？使用油镜按下列步骤操作：1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5

15、、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。六、实验总结实验三 细菌的革兰氏染色一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状

16、。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌；草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。四、操作步骤1涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水

17、洗。（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染用番红液染12分钟，水洗。（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。五、实验报告

18、1结果在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌2思考题P30 思考题1、2、4（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？六、实验总结实验四 放线菌形态的观察、一、目的要求:掌握观察放线菌形态的基本方法，并观察放线菌的形态特征。二、基本原理和细菌的单染色一样，放线菌也可用石炭酸复红或吕氏碱性美蓝等染料着色后，在显微镜下观察其形态。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，使放线菌生长在玻璃纸琼脂平皿上，然后将长菌的玻璃纸剪取

19、一小片，贴放在载玻片上，用显微镜即可观察到放线菌自然生长的个体形态。放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。三、器材灰色链霉菌（Sgriseus）；石炭酸复红染液，吕氏碱性美蓝染液，加拿大树胶，玻璃纸，高氏1号培养基；显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃棒，接种铲，小刀，镊子等。四、操作步骤1放线菌自然生长状态的观察(1)将灭菌后的高氏1号培养基倒入培养皿，每皿倒15mL

20、左右，凝固后备用。(2)用经火焰灭过菌的小镊子将灭菌优质玻璃纸平铺在平皿培养基上，如果琼脂培养基和玻璃纸之间有气泡，可以用灭过菌的玻璃棒将气泡除去。(3)将35ml无菌水倒入弗氏链霉菌的斜面培养物里，制成菌悬液，再适当稀释。(4)用无菌吸管取0.1mL的孢子悬液稀释液，接种在玻璃纸上，并用无菌玻璃棒涂匀后，置28培养，直至菌长好，备用。(5)在洁净的载玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取小片长有菌的玻璃纸，菌面朝上放在载玻片的水面上，使纸平贴载玻片。(6)将载玻片置显微镜下观察。附：玻璃纸灭菌方法在玻璃纸灭菌时，若直接将干燥的玻璃纸灭菌，它就

21、会缩小，不便使用。故需作如下处理：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片，用水浸泡后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。2营养菌丝的观察 (1)用接种铲连同培养基挑取细黄链霉菌菌苔置载玻片中央。 (2)用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥、固定。 (3)用吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染液染0.51分钟，水洗。 (4)干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。3气生菌丝与营养菌丝的比较观察 (1)将高氏1号培养基倒入无菌培养皿，制成4mm左右的培养基平板，经培养检验后无菌，备用。 (2)用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以45度倾斜角插入平皿培养基琼

22、脂内，然后将灰色链霉菌的孢子悬液（浓度以稀释10-210-3为好），接种在盖玻片与平皿培养基的界面上。 (3)倒置于28培养45天后，小心地将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微镜下进行观察。一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。4孢子丝及孢子的观察(1)将培养34天的细黄链霉菌的培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察气生菌丝和孢子丝的形态，注意其分枝情况、卷曲情况等。(2)取清洁的盖玻片一块，在菌落上面轻轻按压一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴吕氏碱性美蓝染液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中，制成印片。用油镜观察孢子的形状、孢子丝等。 (3)

23、取干净载玻片一块，在玻片中央加一小滴加拿大树胶，使树胶摊成一薄层，放置数分钟，使略微晾干（但不要过分干燥）。然后用小刀切取灰色链霉菌培养体一块（带培养基切下）。将培养体表面贴在涂有树胶的玻片上，用另一玻片轻轻按压（不要压碎），然后将放线菌培养体小心弃去，注意不要使培养体在玻片上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰固定，用石炭酸复红染色1分钟，水洗，晾干（不能用吸水纸吸干）。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列情况。五、实验报告1结果:绘图说明你所观察到的放线菌的形态特征。2思考题用玻璃纸覆盖在培养基上，能否培养细菌，为什么？你认为此方法在研究微生物方面可能有些什么用途？六 实验总结实验五

24、酵母菌及子囊孢子的形态观察一、目的要求、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。、学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的子囊孢子生成与否及其形状，是酵母分类上的重要依据。一部分酵母菌只有当它在最适条件下，才能观察到形成的子囊孢子，不同种属的酵母菌，形成子囊孢子的条件不同。葡萄糖-醋酸盐培养基特别有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。本实验用生长在此培养基上的酿酒酵母为材料，进行子囊孢子的观察。三、器材酿酒

25、酵母装片；酿酒酵母；吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红染液，3的酸性酒精，孔雀绿芽孢染液，麦芽汁琼脂斜面培养基，葡萄糖-醋酸盐培养基等；显微镜。四、操作步骤一）酵母菌的形态观察二）酵母菌子囊孢子的观察1将酿酒酵母先移种到新鲜麦芽汁琼脂斜面上，25培养24小时左右。如此活化二次后，备用。2用接种环取活化后的培养物，接种到葡萄糖-醋酸盐斜面上，25培养二周左右。3用接种环挑取少许生长在葡萄糖-醋酸盐培养基上的酿酒酵母于载玻片上，制成涂片，干燥、固定。4用两种方法进行染色。一种方法是加石炭酸复红染液于固定涂片处，在火焰上加热510分钟（不能沸腾），用酸性酒精冲洗3060秒钟，再用水洗去酒精，加吕氏碱性美蓝

26、染液数滴，数秒钟后用水洗去，水干后置显微镜下观察，结果孢子为赤色，菌体为青色；另一种方法是用孔雀绿芽孢染液进行染色，但无需加热，干后置油镜下观察子囊孢子。1.菌落观察取啤酒酵母、假酵母菌以三点点植法接种于麦芽汁平板培养基上，置于2830下培养3天，形成菌落。观察菌落表面、高度、边缘、质地和颜色等方面的特点。2.观察出芽生殖在载玻片上滴1滴蒸馏水，挑取少量啤酒酵母放入蒸馏水中，盖好盖玻片，制成临时装片（注意不要产生气泡）。观察菌体细胞的大小与出芽方式。五、实验报告1、结果：（1）绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。（2）绘图说明你所观察到的酵母菌子囊孢子的形态特征。2、思考题六、实验总结实验六

27、 细菌的特殊染色（芽孢、鞭毛和荚膜）一实验目的：掌握细菌的荚膜、芽孢、鞭毛染色原理及方法，辨认放线菌的营养菌丝、气丝菌丝、孢子丝、孢子的形态，学习放线菌的观察方法。二实验原理：1 夹膜染色 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈，由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。2 芽孢染色 由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，应当用石碳酸复红、结晶紫等进行染色菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红色或浅蓝紫色的圆或椭圆形的圈。用着色强的染色剂孔雀绿或

28、石碳酸复红，在加热条件下染色，是染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的燃料经水洗后被染色，而芽孢一经染色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体便于区分。3 鞭毛染色 在染色前用媒染剂进行处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛的直径加粗，然后在进行染色。三 实验器材1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚；细黄链霉菌培养平皿、棘孢小单孢菌的玻璃纸培养平皿；普通变形菌及牛肉膏蛋白胨培养基斜面2.染色液和试剂 ：Tyler法

29、染色液：用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液（或0.05%碱性复红，石碳酸复红染液、0.1%美蓝染色液3.器材： 载玻片、玻片搁架， 擦镜纸、显微镜、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯、镊子、涂布器、打孔器、细玻棒、凹载玻片等四 实验方法步骤（一）夹膜染色1.负染色法：（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（3）染色：在涂面上加复红染色液染色23min。（4）水洗：用水

30、洗去复红染液。（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。2.湿墨水法（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。3.干墨水法（1）制菌液：

31、加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。（3）干燥：空气中自然干燥。（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。（6）染色：用甲基紫染12min。（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。4.Tyler法（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分

32、混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。（2）干燥：在空气中自然干燥。（3）染色：用Tyler染色液染57min。（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加12滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。5 注意事项1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。3.在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗

33、。（二）芽孢染色1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法（1）制备菌液：加12滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热1520min。（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油

34、镜观察。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。2.Schaeffer与Fulton氏染色法（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过23次。（3）染色：加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。复染：用蕃红液染色5min。（4）水洗、晾干或吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态

35、。结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。3 注意事项（1）.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。（2）.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。（3）.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。（三）鞭毛染色1.镀银法染色（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡56天，使

36、用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养1216h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有12mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液

37、。涂片放空气中自然干燥。用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。（3）染色滴加A液，染46min。用蒸馏水充分洗净A液。用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.51min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。用蒸馏水洗，自然干燥。（4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。2.改良Leifson染色法（1）清洗玻片法同1。（2）配制染料 见附录二（一）9。染

38、料配好后要过滤15-20次后染色效果才好。（3）菌液的制备及涂片菌液的制备同1。用记号笔在洁净的玻片上划分34个相等的区域。放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。干燥 在空气中自然干燥。（4）染色加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。（5）镜检 先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。结果

39、：菌体和鞭毛均染成红色。3 注意事项（1）.镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。（2）.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。（3）.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。（4）.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。五 实验作业：1绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图2 给出鞭毛菌的形态图六、实验总结实验七 培养基的配制及消毒与灭菌及LB培养基的制备一、目的要求1、 了解培养基的种类、掌握培养基的配制、分装方法和灭菌前的准备工作；高压灭菌的原理、

40、使用范围和注意事项。2 、明确培养基的配制原理。3 、通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。二、基本原理LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用

41、稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。LB培养基的配方如下：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 1520g、水 1000mL、pH 7.47.6三、器材酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。四、操作步骤1称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品

42、，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影

43、响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。5加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6包扎

44、加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。8搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。9无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。五、实验报告 1 分析（1

45、） 指出你所配制的培养基中的碳源、氮源、能源、无机盐及生长因子的来源（2） 使用高压灭菌锅的注意事项2 思考题（1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？（2）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？（3）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？六、实验总结 实验八 微生物细胞大小测定和微生物的数量测定一、微生物的显微直接计数法（一）实验目的掌握显微镜下直接计数的技能。二、实验原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采

46、用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000