2022年2022年基因扫描分析非小细胞肺癌病人外周血和骨髓T细胞克隆性增殖及分布特点 .pdf

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1、癌症 2000 年第 3 期第 19 卷 基础研究作者：吴一龙杨学宁李锦添王思愚单位：吴一龙（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州510060）；杨学宁（中山医科大学肺癌研究中心， 广东广州510060） ； 李锦添（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州 510060） ；王思愚（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州510060）关键词： T 细胞受体； V 基因； T 细胞克隆；非小细胞肺癌摘要： 目的：分析非小细胞肺癌（nonsmallcelllungcancer,NSCLC）病人的T 细胞受体 (Tcellreceptor,TCR)V 亚家族 T 细胞的分布及其克隆性增殖特点。方法：利用RTP

2、CR和基因扫描方法分析3例 NSCLC 外周血和骨髓单个核细胞中24 个 TCRV 基因的 CDR3长度， 了解 TCRV T细胞的分布及其克隆性。结果：3 例病人仅存在15 个 TCRV 亚家族，主要为 V3、V7 和 V9，2 例病人出现V7 寡克隆性增殖T 细胞，另 1 例发现 V3 的寡克隆 T 细胞。结论： NSCLC 病人外周血或骨髓的TCRV 亚家族出现倾斜性分布和克隆性增殖 T 细胞，主要为 V3 和 V7 亚家族 T 细胞，这可能是由肺癌细胞相关抗原引起的特异性免疫反应的T细胞克隆。分类号： R371.2 ；R734.2 文献标识码：A 文章编号： 1000467X(2000

3、)03 020404 The feature of clonal expansion and distribution of TCR VT cells from peripheral blood and bone marrow in patients with NSCLCWU Yilong YANG Xue ning LI Jintian et al. （Lung Cancer Research Center, Sun Yat sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P.R.China ）Abstract：Objective：

4、 To investigate the distribution and clonal expansion of TCR V subfamily T cells in patients with non small cell lung cancer (NSCLC). Methods： The CDR3 size of TCR V 24 subfamily genes were analyzed in peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from 3 cases with NSCLC using RTPCR and genesca

5、n, to evaluate the distribution and clonality of TCR V T cells. Results：Only 1 5 V subfamily T cells could be identified in NSCLC cases, the V subfamily T cells main expressed were V 3, V 7 and V 9. V 7 oligoclonal T cells were identified in two cases, whereas V 3 oligoclonal T cells were detected i

6、n the other 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 7 页 - - - - - - - - - case. Conclusions ： The skew distribution and clonal expansion of TCR V subfamily T cells could be found on patients with NSCLC, predominantly in V 3 and V 7. It may be the T cell

7、clones for specific immune response due to the lung cancer cells associatedantigen. Key words ： NSCLC ； T cell receptor； V gene ； T cell clonalityT 细胞受体（ Tcellsreceptor,TCR）是 T 细胞表面识别和结合抗原、参与特异性细胞免疫的重要分子。在T 细胞发育过程中，其可变区（V）、多样区（ D）和结合区（J）的基因片段进行重排，重排时在V-D，D-J 区连接之间可有不同数量的核苷酸随机插入（N 区）, 形成具有高度多样性的可变化区V

8、NDNJ，称为互补决定区(CDR3)1。同一克隆T 细胞重排后， 其 CDR3长度和序列完全相同，而不同克隆T 细胞的 CDR3长度和序列有所不同，其长度的差别可为324 个碱基，对CDR3 长度和序列的分析，可以作为判别T 细胞克隆性的指标1。利用 RT-PCR和基因扫描方法分析TCRV 24 个亚家族的CDR3长度确定 T 细胞克隆性是国外近年开展的新方法2，用于分析肿瘤病人外周血或肿瘤组织浸润性T 细胞中的克隆性增殖 T 细胞情况，借此深入了解机体对肿瘤细胞相关抗原的特异性反应情况2,3。本研究利用该方法分析3 例 NSCLC 病人外周血和骨髓TCRV T 细胞的分布及其克隆性。1 材料

9、和方法1.1 样本经病理确诊的NSCLC 病人 3 例，其中肺鳞癌2 例（L1、L2），肺腺癌1 例（L3）。细胞株 Molt-4和 Jurkat作为单克隆对照，10 例正常人作为多克隆对照，B 细胞株 Raji 作为阴性对照。骨髓取自手术中所切的部分肋骨，外周血和骨髓单个核细胞的分离按常规方法进行。1.2 RNA提取和 cDNA合成RNA提取应用RNAzol 试剂盒（ Gibco，BRL ）并应用随机引物和反转录酶试剂盒（SuperscriptII，Gibco，BRL ）反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。1.3 引物用于非标记PCR的 24 个 V 引物和一C 引物，用于 runo

10、ffreaction的 5端荧光素标记的 C-fam 引物和用于序列分析的5端生物素标记的C-bio引物均由德国柏林TIBMOLBIOL公司合成。引物的核苷酸序列见表12,4。表 1 用于 TCRV PCR的引物的序列名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 7 页 - - - - - - - - - Primer Sequence V1 5 CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC V2 5 GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA V3 5 CG

11、CTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC V4 5 TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA V5 5 AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC V6 5 TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG V7 5 CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC V8 5 CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC V9 5 TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC V10 5 CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC V11 5 TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA V12 5 TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC V13

12、5 CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA V14 5 GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC V15 5 CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG V16 5 GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG V17 5 CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC V18 5 TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA V19 5 TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA V20 5 AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC V21 5 TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT V22 5 AAGTGATCTTGCGCTGTGT

13、CCCCA V23 5 GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA V24 5 CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC C 5 CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG CFam 5 Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG 1.4 RT-PCRPCR按所报道的方法进行2,4。总反应体积为25l ，其中含1lcDNA，任一 V 引物（24 个 V 引物之一） 和 C 引物 （0.5 mol） ， 0.1mmoldNTP,1.25UTaq 聚合酶 (PerkinElmer)和 1PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪 (PerkinElmer)中进行。共进行40 循环，每

14、一循环包括：94、 1min（首次 3min）,60 、 1min 和 72、 1min（末次 10min）， PCR产物保存于4中备用。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 7 页 - - - - - - - - - 1.5 T 细胞克隆性分析1.5.1 Runoffreactions（标记 PCR产物） ：10l 的反应体系含2l 的未标记的PCR产物、 0.1 MC fam 引物、 3mmolMgCl2,0.2mmoldNTP,0.25UTaq 聚合酶和

15、PCR缓冲液(PerkinElmer)。PCR共进行 35 循环，退火温度为66，余同上4。1.5.2 基因扫描分析（CDR3长度分析）：有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的 PCR产物（ 2l ）加入 2.5 l 甲酰胺， 0.5 lGenescan-500Tamra 分子量标准品(ABI,PerkinElmer)和 0.5 l 加样缓冲液(Dextran50mg/ml,EDTA25mmol,Genescan-500TamraKit)，经 94、 4min 变性后，于6聚丙酰胺凝胶中电泳，经373ADNA序列仪（ ABI,PerkinElmer）的基因扫描672 分析软件分析产物的长度和

16、荧光素强度。1.5.3 结果判定：由于V 和 C 引物是固定的，故V/C 所扩增的PCR产物的大小决定于 V-D、D-J 之间重排时的连接片段N区和 D 的长短，即VND NJ (CDR3)，不同的 T 细胞克隆的PCR产物长度和含量有所不同，通过PCR产物的状况，便可了解体内T 细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam) 标记的产物通过基因扫描软件分析， 电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量；峰的形态提示产物的均一性（克隆性），当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，电泳时，其迁移率完全相同， 故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，提示为 PCR产物来自

17、于 CDR3长度完全相同的T 细胞，即单克隆的细胞；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性4,5。2 结果2.1 TCRV 亚家族 T 细胞的表达情况RT-PCR扩增结果： 3 例病人外周血和骨髓分别存在15 个 V 亚家族（表2），正常人表达所有的24 个 TCRV 亚家族， Molt-4和 Jurkat细胞则均为表达单一TCRV 的 T 细胞，分别为V2 和 V8T 细胞。 B 细胞株 Raji不表达任何TCRV 基因。表 2 RTPCR和基因扫描分析TCRV 亚家族T 细胞克隆性的结果引物病例 L1 病例 L2 病例 L3 PB*1BM*2PB

18、 BM PB BM V3 poly*3poly poly oligo oligo V5 poly V6 poly 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 7 页 - - - - - - - - - V7 oligo*4bi*5V9 poly poly 注： 1：外周血， 2：骨髓， 3：多克隆， 4：寡克隆， 5：双克隆 2.2 T细胞克隆性分析结果基因扫描分析结果显示：Molt-4和 Jurkat的 V2 或 V8PCR产物均呈单峰图象（单克隆性）；正常人的全部

19、PCR产物呈多峰图象（多克隆性），2 例肺鳞癌病人中，1 例（L1）在骨髓中发现其V 7 的 PCR产物均呈一主峰及个别矮峰图象（寡克隆），另1 例（ L2）在外周血中其V7 的 PCR产物呈双峰图象（双克隆），另1 例肺腺癌的外周血和骨髓中的V3PCR产物均呈寡克隆图象，其余的V PCR产物均呈多峰图象（多克隆）（图1）。图 1 基因扫描分析TCRV 细胞克隆性结果左图：病例L1 骨髓中所存在的TCRV 7 家族 T 细胞，呈一主峰图像（寡克隆性）。右图：病例L2 外周血中所存在的5 个 TCRV 亚家族的克隆性分布特点，V7 呈双峰图像（双克隆性）; 余为多峰图像（多克隆性）。3 讨论本研

20、究利用RT-PCR分别扩增 3 例 NSCLC 病人外周血和骨髓单个核细胞的TCRV 24 个亚家族基因，了解病人各V 亚家族 T 细胞的分布情况。结果显示病人的TCRV 亚家族 T 细胞出现了明显的倾斜性，或称为选择性表达及优势利用的情况，根据细胞免疫学的基本原理，该结果应与病人存在某些特异性抗原（如肺癌细胞相关抗原等）所引起的刺激有关，另一方面，由于其它亚家族T 细胞的减少，可能与肺癌病人部分细胞免疫功能缺陷有关。用基因扫描对TCRV 阳性的 PCR产物进一步分析其均一性，即分析 CDR3 的长度，了解T 细胞克隆性。 结果显示， 2 例肺鳞癌病人的骨髓或外周血的V7 和 1 例肺腺癌病人

21、的外周名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 7 页 - - - - - - - - - 血和骨髓的V3 亚家族 T 细胞为寡克隆性或双克隆性T 细胞，寡克隆T 细胞提示在该V亚家族中绝大部分的细胞都来自同一克隆，只有极小部分来自其他的克隆，双克隆是两个等位基因出现两种重排的结果，两者均提示该家族的T 细胞为克隆性增殖的T 细胞，这种克隆性增殖的T 细胞可能是机体对肿瘤细胞相关抗原的一种直接反应，近期 Echchakir等8有关肺癌组织中的TCRV 亚家族分析也证

22、明了这一点。目前多数研究报道均未有明确提出哪种肿瘤与哪一个或哪些TCRV 亚家族 T 细胞克隆有关。 在同一种肿瘤的不同病例中出现的克隆性增殖T 细胞不一定相同，并可能出现一个或多个 TCRV 亚家族 T 细胞克隆，其原因一方面由于病例数少，未能更好地发现其共性，另一方面，也可能与个体特异免疫和肿瘤的异质性有关1,2,4,5。值得注意的是2 例肺鳞癌病人中有均同时出现V 7 亚家族的克隆性增殖T 细胞，提供了一定的趋向性，这些T 细胞的真正功能有待积累病例做进一步的研究。在黑色素瘤病人的研究中，Puisieux等2发现在同一病人的不同部位活检组织的TIL和不同时间的TIL 表现相同的克隆性T

23、细胞，提示这些克隆性增殖的细胞是对肿瘤相关抗原的免疫反应。 Maccalli等6证明了表达某些TCRV 的克隆性 T 细胞对自身肿瘤细胞的特异杀伤作用。最近Semino 等9更发现 V3 和 V7 阳性的 T 细胞为自身肺癌细胞的特异性细胞溶解性淋巴细胞，为本研究的深入提供了可喜的证据。目前利用病人克隆性增殖T 细胞作为特异性免疫治疗的研究已开展7， 但对肺癌的类似研究甚少。本研究在国内首先报道NSCLC克隆性增殖T 细胞的情况，对这些克隆性增殖T细胞对肺癌特异性杀伤作用做深入的分析，是一项十分有意义的工作。基金项目： 本课题受卫生部科学研究基金(98 2377) 资助通讯作者： 吴一龙： T

24、el ：862087580159 Fax ： 862087536401 E mail ： 参考文献：1Sensi M, Parmiani G. Analysis of TCR usage in human turmors： a new tool for assessing tumot specific immune response J. Immunol today, 1995, 16： 588 595. 2Puiseux I, Even J, Pannetier C, et al. Oligoclonality of tumor-infiltrating lymphocytes from h

25、uman melanomas J. J Immunol, 1994, 153： 2807 2818. 3Thor Straten P, Guldberg P, Gronbeak K, et al. In situ T cell responses against melanoma comprise high numbers of locally expanded T cell clonatypes J. J Immunol, 1999, 163： 443 447. 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 -

26、 - - - - - - 第 6 页，共 7 页 - - - - - - - - - 4李扬秋 , 汪明春 , 吴幼华 . 利用基因扫描分析TCRV 亚家族的 CDR3长度的方法检测T 细胞克隆性 J.中国免疫学杂志,1998,14 ：4850. 5李扬秋 , 吴一龙 .TCRV 基因谱系在检测肿瘤病人T 细胞克隆性中的研究J.国外医学 肿瘤学分册 ,1999,26 ：137139. 6Maccalli C, Farina C, Sensi M, et al. TCR beta-chain variable region-driven selection and massive expansi

27、on of HLA-class I-restricted antitumor CTL lines from HLA-A* 020 melanoma patients J. J Immunol, 1997, 158： 5902 5913. 7Mackensen A, Veelken H, Lahn M, et al. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes by immunization with autologous tumor cells and interleukin-2 gene transfected fibroblast

28、s J. J Mol Med, 1997, 75： 290 296. 8Echchakir H, Asselin-paturel C, Dorothee G, et al. Analysis of T-cell receptor beta-chain-gene usage in peripheral-blood and tumor-infiltrating lymphocytes from human non-small-cell lung carcinomas J. Int J Cancer, 1999,81：205 213. 9Semino C, Cilli M, Rstto GB, et

29、 al. Limiting dilution analysis of peripheral blood lymphocytes reacting with non-small cell lung cancer： Functionally heterogeneous effectors efficiently lyse autologous cancer cells J. Lung Cancer, 1998,21 ： 27 36. 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 7 页 - - - - - - - - -