临床免疫学检验名词解释重要知识点.docx

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1、抗原抗体反应：是指抗原和相应抗体在体内或体外发生特异性结合反应。抗原抗体间结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子排斥而趋向聚集力。亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点和一个相应抗原表位（AD）之间结合强度，取决于两者空间结构互补程度。亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子抗原结合部位和若干相应抗原表位之间结合强度，它和亲和性、抗体结合价、抗原有效AD数目有关。抗原抗体反应特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应现象。在凝集反应或沉淀

2、反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原和抗体结合但不能形成大复合物，从而不出现肉眼可见反应现象。抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞抗原。免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或和抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原免疫应答或改变免疫应答类型物质。半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有和抗体结合能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）物质。当半抗原和蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性物质。载体效应：初次免疫和再

3、次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原免疫应答，该现象称为。单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生针对单一表位、结构相同、功能均一抗体，即。多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位免疫球蛋白，即基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体基因进行改造和装配，经导入适当受体细胞后重新表达抗体。杂交瘤技术【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体小鼠脾细胞和能在体外

4、长期繁殖小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷 （HAT）选择性培养基作用，只让融合成功杂交瘤细胞生长，经反复免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价单克隆抗体。（一）小鼠骨髓瘤细胞理想骨髓瘤细胞条件：细胞株稳定，易于传代培养；细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；该细胞是HGPRT或TK缺陷株；能和B细胞融合成稳定杂交瘤细胞；融合率高。目前最常用是NS-1和SP2/O细胞株（二）免疫脾细胞多采用和骨髓瘤细胞同源纯系BALB/c小鼠；免疫途径多

5、为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全弗氏佐剂。（三）细胞融合是产生杂交瘤细胞中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作细胞融合剂，浓度3050 %之间，基本方法是将骨髓瘤细胞和脾细胞按1:2 1:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核异核体，最终产生杂交细胞。（四）杂交瘤细胞选择性培养肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢

6、受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），经HAT培养液筛选后，只有具备两亲本 细胞双重特性杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体细胞源。细胞类型正常培养细胞TK缺陷细胞HGPRT缺陷细胞杂交瘤细胞正常培养基+HAT培养基+-+凝集反应（agglutination reaction）：是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）颗粒性载体和相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见凝集现象。直接：在适当电解质参和下，细菌、螺旋体

7、和红细胞等颗粒性抗原直接和相应抗体结合后出现肉眼可见凝集现象，称为。间接：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）表面，然后和相应抗体（抗原）作用，在适宜电解质存在条件下出现特异性凝集现象，称为。其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中待检抗体。反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中待检抗原。间接凝集抑制反应：用抗原致敏载体颗粒及相应抗体作为诊断试剂，检测标本中是否存在和致敏抗原相同抗原。间接血凝试验：是以红细胞为载体间接凝集试验，即用已知抗原（或抗体）致敏红细胞，和标本中相应抗体（或抗原）

8、特异结合，出现红细胞凝集现象。胶乳凝集抑制试验（LAT）：将抗原（或抗体）致敏胶乳颗粒，直接和待检标本中抗体（或抗原）发生凝集反应。（常用载体颗粒为聚苯乙烯胶乳）直接coombs试验：将抗人球蛋白试剂直接加到表面结合抗体受检红细胞中，即可见细胞凝集。用于检测吸附于红细胞表面不完全抗体。（如HDN、AIHA）间接coombs试验：将受检血清和具有相应抗原性红细胞相结合，再加入抗人球蛋白抗体即可出现可见红细胞凝集。用于检测血清中游离不完全抗体。沉淀反应（precipitation reaction）：是指可溶性抗原和相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见沉淀现象。免疫浊度测定：是应用抗原抗体

9、结合在液体中形成免疫复合物干扰光线可用仪器检测特点，将现代光学测量仪器和自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定技术。钩状效应（high dose hook effect）：免疫浊度测定，抗原过量导致形成免疫复合物（IC）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。单向免疫扩散实验：是先将一定量抗体混于琼脂凝胶中，使待测抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散，在一定区域内形成可见沉淀环。环直径或面积大小和抗原含量正相关。常用于IgG/A/M、补体 C3/C4等血浆蛋白测定。双向免疫扩散试验：是将抗原核抗体加在同一琼脂板对应孔中，各

10、自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线。沉淀线靠近抗原孔，说明抗体浓度较大；靠近抗体孔则说明抗原浓度大。形成沉淀线弯向分子量大一方。（待测物为两种抗原）两条沉淀线互相吻合相连，两抗原中存在相同表位；两条沉淀线交叉，说明两抗原完全不同；两条沉淀线相切，提示两抗原之间有部分相同。对流免疫电泳（CIEP）：实质上是双扩和电泳结合。在pH8.6碱性缓冲液琼脂中进行电泳，分子量小、等电点低、带有较多负电荷Ag泳向阳极，而Ab球蛋白等电点偏高（约为6-7），在pH8.6时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指电场中液体对固体支持物相对移动）干扰后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内

11、即可相遇，在孔间两者分子比例合适地方形成沉淀线。（抗原加在-级，抗体加在+级）抗原浓度越高，沉淀线越接近抗体孔，甚至超过抗体孔。本法简便快速，灵敏度是双扩816倍，可检出蛋白质浓度达g/ml，常用于Ag/Ab性质/效价/纯度测定。火箭免疫电泳（RIE）：实质上是单扩和电泳结合。是将抗体混合于琼脂中，电泳时，抗体不移动，抗原由负极向正极移动，并随抗原浓度下降，抗原泳动基底区也逐渐变窄，抗原抗体免疫复合物形成沉淀西安也越来越窄，形成一个火箭状不溶性复合物沉淀峰。抗体浓度一定时，沉淀峰高度和抗原量呈正相关。其灵敏度可达ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。免疫电泳（IEP）：将待测标本（蛋白质抗原

12、）置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因所带电荷、分子量及构型不同，被分成肉眼不可见若干区带。然后沿和电泳方向开一平行抗体槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散。18-24h后，各区带蛋白和相应Ab在相应位置上形成弧形沉淀线。Ag越多，沉淀线越靠近Ab槽，其沉淀线越粗，可做细微蛋白质组分分析，仅为定性实验。免疫固定电泳（IFE）：实质是区带电泳和沉淀反应相结合。先将血清蛋白质置于琼脂凝胶中进行区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加于凝胶表面泳道上，经过孵育，固定剂和抗血清在凝胶内渗透、扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离抗体，形成抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经氨基黑，参

13、考泳道和抗原抗体沉淀区被着色，根据电泳移动距离分离单克隆组分，可对各类Ig及其轻链进行分型。最常用于M蛋白鉴定。放射性核素：具有放射性核素，在自然条件下可发生自发性转化变为另一种（放射性）核素，并同时释放射线。这一转变过程称为放射性衰变。放射化学纯度：指在标记物中结合在抗原（或抗体）上放射活性占该标记物总放射活性百分比。比放射活性：是指单位质量标记物中所含放射性活度，或每分子抗原（或抗体）平均所结合放射性原子数目。放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素标记抗原和非标记抗原（待测/标准抗原）同时和限量特异性抗体进行竞争性结合反应，通过测定放射性核素标记抗原和抗体复合物放射性活度，经相应数学函数

14、关系推算待测抗原含量。免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性标记抗体来测定样品中抗原方法，所用标记抗体是过量，抗原全部是非标记。待测抗原和过量标记抗体结合反应形成标记抗体-抗原复合物及游离标记抗体，测定是标记抗体-抗原复合物量.荧光免疫技术：是将抗原抗体反应和荧光技术相结合而建立一种免疫荧光技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。荧光抗体技术（FAT）：以荧光素标记抗体对抗原进行定位染色，并借助荧光显微镜观察标本片上荧光染色形态，从而判断是否存在待测抗原，这种技术就是。荧光抗体染色方法：直接法（简便快速特异性强，但敏感性不如间接法，一种荧光抗体只能检测一种抗原）、间接法（敏感性比直接法高510倍

15、，一种荧光二抗可检测多种抗原/抗体，但容易产生非特异性荧光）、双标记法（用于检测同一标本中两种抗原）荧光：荧光物质吸收激发光能量后，使原来处于基态电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态电子以发射光形式释放出能量，这种发射光称为。发射光谱：是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到样品发射荧光谱图激发光谱：是指固定检测发射光（荧光）波长，用不同波长激发光照射样品得到荧光谱图。荧光效率：是指荧光分子将吸收光能转变成荧光百分率，和发射荧光光量子数值成正比。荧光效率发射荧光光量分子数（荧光强度）吸收光光量子数（激发光强度）荧光猝灭：荧光分子辐射能力在受到激发光较长时间照射后会减弱现象。只有那些能产生

16、明显荧光有机化合物才能作为荧光色素。stokes位移：即激发光谱和发射光谱波长差。镧系元素stokes位移大（273nm），激发/发射光谱不重叠，可减少干扰。酶免疫技术：是将酶高效催化反应专一性和抗原抗体反应特异性相结合一种免疫标记检测技术。是将酶和抗原或抗体结合成酶标记结合物（酶标抗原/抗体），酶标结合物既保留了抗原/抗体免疫学活性，同时也保留了酶对底物催化活性。在酶标记抗体（抗原）和抗原（抗体）特异性反应完成后，加入酶作用相应底物，通过酶催化底物产生显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量测定。常用酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）、-半乳糖苷酶（-Gal）常用底物：HR

17、P有邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）。ALP为对-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。-Gal为4-甲基伞形酮-D半乳糖苷（4MUG）常用标记方法：交联法（戊二醛）和直接法（改良过碘酸钠法）固相载体选择：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜载体包被（coating）：将抗体或抗原结合在固相载体上过程。封闭（blocking）：用1%5%牛血清蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合位点，消除非特异性吸附干扰。酶联免疫吸附试验（ELISA）【基本原理】把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗体）；将抗原或抗体和酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保

18、留酶活性）；在测定时，把受检标本（测定其中抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同步骤和固相载体表面抗原或抗体起反应，用洗涤方法使固相载体上形成抗原抗体复合物和其它物质分开，最后结合在固相载体上酶量和标本中受检物质量有一定比例，加入酶反应底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物量和标本中受检物质量直接相关，根据颜色反应深浅进行定性或定量分析。（一）ELISA检测抗原方法主要有：1、双抗体夹心法：适用于至少两个抗原决定簇（AD）Ag。先将特异性抗体和固相载体结合，形成固相抗体，加入待测标本并温育，使标本中抗原和固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育，使固

19、相抗体抗原复合物和酶标记抗体结合，形成 固相抗体-待测抗原-酶标记抗体 复合物，为“双抗体夹心”；洗涤去除游离酶标记抗体。加入底物，固相载体结合酶可催化底物成为有色产物，根据产物显色程度进行抗原定性或定量检测。临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG等项目检测。2、双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远抗原决定簇，分别制备两种单克隆抗体，在包被时使用一种单抗，酶标记时使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标记抗体同时加入反应体系，两种抗体分别和不同抗原决定簇结合，只进行一次温育，在洗涤后即可加底物进行显色反应。担当待测抗原浓度过高时，可

20、出现钩状效应，甚至出现假阴性结果，必要时可将标本适当稀释后重新测定。）3、竞争法：适用于小分子Ag或半抗原（只有一个AD）。先用特异性抗体包被固相载体，然后同时加入待测抗原和酶标记抗原，待测样本中抗原和酶标记抗原 竞争性和固相载体上特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色。（二）ELISA检测抗体方法主要有：1、间接法：检测Ab最常用方法。常用酶标记羊抗人IgG。2、双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法，原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，但一般不会出现钩状效应。临床上乙型肝炎表面抗体HBsAb测定常用此法。3、竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除杂质，不易得到

21、足够纯化抗原或抗原性质不稳定时，可采用此方法。主要用于测定HBcAb和HBeAb。原理见下：（1）HBcAb竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，然后加入待测标本和酶标记特异性核心抗体，此时待测标本中HBcAb和酶标记HBcAb竞争性地和固相载体上核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色强弱和待测标本中HBcAb含量负相关。（2）HBeAb竞争法：先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，此时待测标本中HBeAb和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg，温育后洗涤，加入酶标记HBeAb，酶标记抗体和结合于固相抗体上特异性抗原结合，温育后洗

22、涤，加入底物显色，显色强弱和待测标本中HBeAb含量呈负相关。4、捕获法：又称反向间接法，主要用于血清中特定Ig类别测定，最常用于病原体急性感染诊断中IgM型抗体检测。原理：首先将针对IgM第二抗体包被于固相载体形成固相抗体，加入待测标本后，标本中所有IgM（特异/非特异）即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原，其和固相载体上捕获IgM特异性抗体结合，再加入针对特异性抗原酶标记抗体，形成 固相抗人链IgM-抗原-酶标记抗体 复合物，最后加入底物显色，即可对待测标本中抗原特异性IgM进行定性或定量测定。此法临床上常用于病原体急性感染实验室诊断，如急性甲肝时可检测HAV-IgM抗体，急性乙型肝炎

23、时可检测抗HBc-IgM抗体。发光免疫分析（CLIA）：是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来一种检测微量抗原或抗体新型标记免疫分析技术。兼有高灵敏性和高特异性。发光：分子/原子中电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并施放光子过程。化学发光：伴随化学反应过程所产生光发射现象。发光效率：又称化学发光反应量子产率，是指发光剂在反应中发光分子数和参加反应分子数之比，取决于生成激发态产物分子化学激发效率和激发态分子发射效率。化学发光免疫技术可分为均相反应（不需分离）和非均相反应（需要分离）非均相分离方式有：固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离。【化学发

24、光剂】直接化学发光剂：鲁米诺和吖啶酯（常用）间接化学发光剂：鲁米诺及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物【标记技术】常用标记方法：碳二亚胺缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法影响标记因素：发光剂选择、被标记蛋白质性质、标记方法选择、原料比、标记率、温度、纯化和保存。化学发光酶免疫分析（CLEIA）【原理】：是用参和催化某一化学发光反应酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗体（或抗原），和待测标本中相应抗原（或抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体 复合物，经洗涤后加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。由光量子阅读系统接收，光电倍

25、增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物浓度。【特点】：属酶免疫测定范畴，测定过程和ELISA类似，仅最后一步酶反应底物改为发光剂、测定仪器改为光信号检测仪；酶标记抗原或抗体结合稳定；酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发出光稳定，持续时间长，便于记录和测定。电化学发光免疫分析（ECLIA）【原理】是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应（它包括电化学和化学发光两个过程）。在反应体系内待测标本和相应抗体发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体 复合物，复合物

26、进入流动室，同时注入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在点击下面电磁铁吸引住，而未结合标记抗体和标本缓冲液被冲走。和此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光信号由安装在流动室上方光信号检测器检测，光强度和待测抗原浓度成正比。【特点】：三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供电子，可周而复始发光，持续时间长，信号强度高，容易测定、控制；三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物理化特性；试剂灵敏度高，稳定性好。 生物素（B）又称维生素H ，分子式为C10H16O3N2S，等电点（pI）为3.5。生物素结构中，I 环为咪

27、唑酮环，是和亲合素结合主要部位；II 环为噻吩环，含有一个戊酸侧链，末端羧基是标记抗体或其他分子唯一结构。抗体分子经生物素化后，其结合抗原活性不受影响。多种酶经生物素化后，其催化能力保持不变或稍有降低。生物素-亲合素系统【特点】：高特异性、高敏感性、稳定强、实用性强 【应用】：在标记免疫技术中可应用于标记信号放大环节，也可用于固相包被（或分离）环节 一、应用于固相载体包被环节链霉亲合素（亲合素）为弱酸性蛋白，可以吸附在固相载体（聚苯乙烯微孔板或纳米微球）表面，形成链霉亲合素包被固相载体；利用生物素标记抗原（或抗体），使待包被抗原（抗体）通过生物素和固相材料表面链霉亲合素结合，实现间接包被。此种

28、包被模式不但可增加抗原（或抗体）包被数量，也可减少空间位阻效应，提高抗原（或抗体）利用效率。此外，若固相材料不和生物素化抗原（或抗体）结合，待生物素化抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）反应后，再加入链霉亲合素预包被磁性纳米微球，含有生物素免疫复合物可结合在固相载体表面，达到同样分离效果。二、应用于检测系统信号放大生物素-亲合素系统用于检测信号放大，可提高标记免疫分析敏感性。基本方式有 生物素-亲合素-生物素 模式（BAB）和 生物素-亲合素 模式（BA）或标记亲合素模式。如将生物素标记在第一抗体上称为直接法，如生物素标记在第二抗体上称为间接法。生物素-亲合素-生物素模式特点是生物素标记分子（如

29、生物素标记抗体/酶蛋白），以游离亲合素为桥，连接 抗原-抗体 和信号检测系统；由于一个亲合素分子能同时结合4个生物素，且一个生物素大分子可标记多个生物素而产生级联放大效应，提升检测敏感性。实际应用中ABC法：预先按一定比例将亲合素和生物素标记示踪物质（如生物素标记ALP）混合，形成可溶性 亲合素-生物素化酶标 复合物，同时确保预留一定位点和生物素化抗体（或抗原）结合。此种方法能减少操作步骤，又能实现标准化操作（有商品化试剂）。将ABC法应用于双抗体夹心ELISA中，形成ABC-ELISA，为常用方法。 固相膜免疫分析技术：是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可以通过毛细管作用在膜上

30、向前移行特性，以酶标记或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等）标记抗体或抗原作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测快速检验方法。胶体金免疫技术：是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应一种标记免疫测定技术。胶体金：也称金溶胶，是金盐被还原为金原子后形成金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外双离子层构成（内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷H+）。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定胶体状态，形成带负电疏水胶溶液，故称胶体金。免疫金：是指胶体金和抗原或抗体等大分子物质结合物。其制备过程实质上是抗体蛋白等大分子被吸附到胶体金颗粒

31、表面包被过程。（一）斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）【原理】是在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时和膜上抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目（一般5min左右完成）阳性反应在膜上呈现红色斑点。本法简化了操作步骤，达到简便目，已成为“床旁检测（POCT）”主要方法之一。【方法类型】： 双抗体夹心法：将抗体包被在硝酸纤维素膜中央，滴加待检标本，若标本中有待测抗原则在渗滤过程中和膜上抗体结合，然后滴加胶体金标记抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。间接法：将抗原包被在硝

32、酸纤维素膜上，依次滴加待测标本、洗涤液和胶体金标记抗人IgG抗体，再加洗涤液洗涤， 阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。本法因受非目IgG干扰，易产生假阳性，临床上较少使用。（二）斑点金免疫层析试验（DICA）【原理】是将胶体金标记和蛋白质层析 技术相结合，以硝酸纤维素膜为载体快速固相膜免疫分析技术。在DICA中，滴加在膜一端标本溶液受载体末毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物和固定于载体膜上某一区域抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金呈色条带来判读实验结果。【方法类型】：双抗体夹心法、竞争法、间接法（三）临床应用及评价1、特点：操作

33、简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、便于保存等特点。2、灵敏度问题：灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，临床应用中应引起高度重视。3、临床应用：临床只能作为定性/半定量 试验，目前主要应用于正常体液中不存在物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高物质（如人绒毛膜促性腺激素HCG）。 斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）【原理】和常规ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为对蛋白质具有极强吸附力（近100%）硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色沉淀物，使NC染色。【技术要点】1、抗原包被膜：加少量（12L

34、）抗原于膜上。由于NC膜吸附力强，故需在包被后进行封闭。2、抗原抗体反应：滴加样品血清，其中待检抗体即和NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗。3、显色反应：滴加能形成不溶有色沉淀底物溶液（如HRP标记物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见染色斑点。【方法评价】斑点-ELISA优点为：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高68倍；试剂用量较ELISA约节约10倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果NC膜可长期保存（-20可长达半年），不影响其活性。免疫印迹试验（IBT）亦称酶联免疫电转移印迹法（EITB），通常又称

35、Western-blot。【原理】是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析相结合技术，具有分析容量大、敏感性高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达和分布一种常用方法，如组织抗原定性定量检测、多肽分子质量测定及病毒抗体或抗原检测等。【技术要点】1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极涌动，分子量越小，涌动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有染色后才显出电泳区带）。2、电转移：将在凝胶中已经分离条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（12A），通电45min转移即可完成。此阶段分离效果肉眼仍不

36、可见。3、酶免疫定位：将印有蛋白质条带硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原固相载体）依次和特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物酶反应底物，使区带染色。常用HRP底物为3,3-二氨基联苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应条带清晰可辨。并可根据SDS-PAGE时加入分子量标准，确定各组分分子量。【方法学评价】1、抗体性质：影响本试验成败一个主要因素是抗原分子中可被抗体时别表位性质。只有那些能识别耐变形表位抗体可和抗原结合，所以在该试验中常选用多克隆抗体。2、IBT灵敏度：一种是在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩。其他方法都是针对增强信号本身设计，包括使用信号

37、更好和更强荧光实际或使条带局部酶活性增强等。3、IBT法在临床应用中存在一定局限性。非标记抗体酶免疫组织化学染色首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体和组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体损伤，同时也提高了方法敏感性【技术类型】（一）酶桥法抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体）将特异性识别组织抗原第一抗体连接，形成酶联 抗原-抗体 复合物，加底物显色。 本法较酶标法敏感性有所提高，但操作分四步较为复杂。（二）过氧化物酶抗过氧化物酶酶（PAP）法是在酶桥法基础上加以改良。本法首先将酶桥法第三抗体（抗酶抗体）和酶组成可溶性复合物（PAP复合物）。该

38、复合物由两个抗酶抗体和三个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原第一抗体和PAP复合物抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体和第三抗体动物种属相同和酶桥法相比，PAP法操作简便，分三步；PAP复合物结构稳定，避免了酶桥法中标记易脱落弊端；敏感性高；背景着色淡，因为即使桥联抗体存在有非特异性抗体可能，但因其和第一抗体并非同种属，故不能和抗酶抗体结合。并且，如果抗酶抗体中存在着非抗酶抗体，当其和桥抗体或组织成分结合时，由于其不能和酶结合，也不会产生非特异性反应。（三）双桥PAP法该法建立在PAP法基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体

39、和PAP复合物而建立起来，通过双桥可结合更多PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体和PAP复合物中抗酶抗体未饱和Fc段结合，或桥抗体和特异性第一抗体未饱和Fc段结合。如此对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原检测又实用价值。（四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP）法因部分组织细胞内含内源性过氧化物酶，限制了HRP广泛应用，需选用其他酶免疫组织化学反应。本法是用碱性磷酸酶（ALP）代替HRP建立碱性磷酸酶（ALP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP。其技术要点和PAP法相似。【常用酶及显色底物】最常用是辣根过氧化物酶（HRP），常用供氢体有二

40、氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色其他有：氨基乙基卡巴唑（AEC），反应产物为橘红色；4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。碱性磷酸酶为磷酸酯水解酶，可通过两种反应显色：偶氮偶联反应，最终和重氮化合物作用生成不溶沉淀，如快蓝为深蓝色，快红为红色。靛蓝四唑反应，最终形成紫蓝色不溶沉淀。其他标记酶还有葡萄糖氧化酶（GO）、-半乳糖酶等；前者底物为葡萄糖，配以NBT和PMS，呈蓝色沉淀。对含有丰富内源性过氧化物酶组织切片（如淋巴/肿瘤组织），首选ALP标记免疫组织化学方法（但HRP比ALP染色结果保存时间长）。GO存在敏感性不高、显色底物不易保存等缺点。ALP和HRP结合可进行双重或三重免疫组织化学标记。 流式细胞术（FCM）：是以流式细胞仪为检测手段一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选新技术。【工作原理】采用激光作为激发光源，保证其具有更好单色性和激发效率；利用荧光染料和单克隆抗体技术结合标记技术，保证检测灵敏度和特异性；用计算机系统对流动单细胞悬液中单个细胞多个参数信号进行分析处理，保证了检测速度和统计分析精确性。因而能同时从一个细胞上获取多种参数资料，保证对该细胞进行详细分析。