恶性肿瘤发生发展细胞表观遗传机制.docx

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1、项目名称：恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制首席科学家：尚永丰 北京大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标总体目标：本项目瞄准表观遗传学研究的前沿，整合国内优秀研究人员，系统深入地开展恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的表观遗传学研究。本项目的总体目标如下：阐明表观遗传关键机制即DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA对基因表达调控的影响；明确表观遗传调控在乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移中的作用；揭示EMT过程中的表观遗传学变化及细胞重编程机制；阐明细胞微环境在肿瘤转移中的作用及机制；整合各种信息数据，描绘乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。通过本项目的实施，建

2、立和完善表观遗传学研究的新的技术体系，实现我国在生命科学及医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供新思路、新途径和新靶标，发现几个潜在的可以用于乳腺癌、肺癌诊断的分子标志物及药物治疗的分子靶标，并在本项目的实施过程中建立一支具有国际竞争力的研究团队。五年预期目标：1、 发现一批新的组蛋白修饰因子，探明组蛋白修饰与DNA甲基化之间相互作用的分子机制，筛选一批肿瘤相关ncRNA，鉴定一批具有潜在临床应用价值的肿瘤诊断及治疗的新的ncRNA分子靶标；鉴定一批新的EMT关键调控因子；发现针对转移型乳腺癌、肺癌的新的有效治疗靶点。2、 建立一整套适应于恶性肿瘤表观遗传学研究的技术

3、平台和技术体系。3、 培养一批中青年学术带头人和学术骨干；培养研究生（含硕、博）50名以上、博士后12名以上。4、 在国际一流杂志（IF10）发表论文8篇以上，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文25篇以上。三、研究方案本项目分为六个课题，将全面系统地研究乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移的表观遗传机制，为乳腺癌和肺癌的预防、诊断、治疗提供分子标志及药物靶标。前三课题分别从DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA三个不同角度，分析肿瘤发生发展及侵袭转移中表观遗传学改变，研究其相互之间的作用关系及分子调控机理；第四课题将对肿瘤转移过程中非常重要的现象即上皮间质转换的细胞重编程机制进行探讨；第五课题从肿

4、瘤微环境的角度，探讨肿瘤微环境中基质细胞及细胞因子对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响；第六课题整合所有的信息，描绘乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。六个部分各有侧重，又紧密衔接，团结合作，互相促进。课题一：DNA甲基化变化在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用本研究将筛选肿瘤细胞中高甲基化并失活的基因并分析其启动子区域组蛋白的修饰状况，探讨DNA甲基化与组蛋白修饰的先后关系。筛选出影响DNA甲基化酶和DNA结合的关键性因子或蛋白；明确相关关键性因子或蛋白与DNA甲基化酶及DNA结合蛋白作用的分子机制，进一步明确特定基因发生DNA甲基化的分子机制，进而揭示组蛋白修饰与DNA甲基化

5、相互作用的分子机制。另外在肿瘤组织，CBX7等PcG蛋白的正常组合关系被破坏，并且这种PcG蛋白组合紊乱与肿瘤相关基因失活之间可能存在因果关系。本研究还将以多种器官的正常组织和肿瘤组织为对象，了解正常组织细胞中PcG蛋白的正常组合关系，研究这种正常组合关系破坏与肿瘤发生的关系及其与肿瘤相关基因组蛋白修饰、核小体定位和DNA甲基化发生的关系。表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和获得多能“干性”方面发挥关键性作用，也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭/转移能力的物质基础。本研究将在开展肿瘤转移相关DNA甲基化组学研究的基础上，筛选并鉴定出影响肿瘤细胞转移能力的关键性DNA甲基化变化位点及其网络，了解

6、其在癌细胞获得转移能力重编程过程中作用，建立预测恶性肿瘤转移能力的表观遗传分子分型体系。总体研究方案如下：肿瘤DNA甲基化组和应用研究DNA甲基化形成机制研究代表性肿瘤及非瘤组织标本收集500例肿瘤DNA甲基化组测定启动子芯片基因功能分析生物信息学分析确定肿瘤发生/转移/侵袭相关的甲基化网络验证研究：大样本患者随访、模式动物建立肿瘤转移能力的DNA甲基化分型体系RLGS/MeDIP/Promoter array等方法分析肿瘤基因组甲基化谱式分析肿瘤细胞中异常甲基化的启动子区域组蛋白修饰的状况ProfileProfile筛选影响DNMT和DNA结合及组蛋白修饰的关键蛋白探讨关键蛋白活性和自身修饰

7、的变化明晰特异基因发生DNA甲基化的分子机制和组蛋白修饰调控DNA甲基化的分子机制探明关键蛋白与DNMT和DNA结合蛋白相互作用的分子机制课题负责人：朱卫国，北京大学学术骨干：邓大君，北京大学伍会健，大连理工大学生命科学与技术学院课题二：组蛋白修饰异常在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用本课题将常规方法和高通量技术相结合，从筛选乳腺癌和肺癌中新的组蛋白修饰调控因子及其复合物出发，逐步揭示所获得的候选基因对于组蛋白修饰的作用和调控机理，并进一步阐明这些基因在调控肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用及其机制。将以功能基因组学和蛋白质组学的方法筛选乳腺癌和肺癌中发生突变或者表达异常的组蛋白修饰酶以及转录因

8、子，同时针对MLL1等相关的甲基化酶复合物组分，LSD1等去甲基化酶、EYA去磷酸化酶和磷酸化激酶、转录因子Smad4和ER及其转录辅助因子等，筛选新的组蛋白修饰基因或miRNA，利用各种蛋白质间相互作用方法验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用。利用基因过量表达和敲低/敲除技术、基因突变技术、组蛋白甲基化、磷酸化和乙酰化分析、ChIP-seq等技术检测分离的组蛋白修饰因子对组蛋白修饰和基因表达的影响及其在基因表达调控中的分子机制。在此基础上，利用动物模型和临床标本对组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用做深入分析。总体研究方案如下：组蛋白修饰异常机制与肿瘤发生发展筛选

9、新的组蛋白修饰复合物/因子甲基化酶、磷酸酶、Smad4和ER转录因子等相互作用分析组蛋白修饰分析靶基因表达分析建立肿瘤发生发展侵袭转移相关的组蛋白修饰网络高通量芯片、酵母双杂交、免疫沉淀-质谱课题负责人：叶棋浓，军事医学科学院生物工程研究所学术骨干：杨晓，军事医学科学院生物工程研究所课题三：非编码RNA在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用研究ncRNA作用机制的一个关键就是鉴定与之相互作用的靶分子，特别是蛋白分子。本课题将以乳腺癌细胞系、肿瘤组织、肿瘤启动细胞为模型，利用自主建立的RNA-SELEX-seq技术平台系统地发现和鉴定与肿瘤相关蛋白（特别是其中的转录因子和表观修饰酶）发生相互作用的

10、ncRNA；还将采用不同大小的ncRNA的cDNA文库（size-fractioned RNA library）鉴定肿瘤启动细胞特异的ncRNA。采用球囊形成实验、二维平皿及三维Matrigel培养以及免疫缺陷鼠体内种植和肿瘤组织等研究体系，系统深入地研究ncRNA和蛋白间的相互作用、它们所构成的结构网络、调控网络、以及这些相互作用的生理功能，剖析ncRNA调控网络在肿瘤发生发展进程中的作用与意义。与此同时，选择其中一些有重要功能的ncRNA，结合大量的肿瘤患者的标本及临床资料，研究将其作为药靶或生物标记物的可能性。非编码RNA与肿瘤发生发展研究肿瘤相关蛋白结合的ncRNA的研究阐明ncRNA

11、-蛋白调控网络与肿瘤发生发展的关系RNA-SELEX-seq技术平台鉴定与肿瘤相关蛋白结合的ncRNASize-fractioned RNA library鉴定肿瘤启动细胞特异ncRNA探讨ncRNA-蛋白相互作用及对相关信号通路的调控利用体外培养、免疫缺陷小鼠肿瘤移植、肿瘤病理组织检测等进行功能研究课题负责人：宋旭，四川大学学术骨干：宋尔卫，中山大学李沁桐，四川大学课题四：上皮间质转换的机理及恶性肿瘤侵袭转移的细胞重编程机制以乳腺癌细胞系、肿瘤组织及癌旁正常组织为模型，探讨EMT的细胞重编程作用机理及其在乳腺癌转移及化疗药物耐受中的作用。选取永生化的正常乳腺细胞系（如MCF-10A），ER阳

12、性低转移性细胞系（如MCF-7，T47-D等），ER阴性高转移细胞系（如MDA-MB-231，SUM1315等），以及ER阳性但对三苯氧胺耐药的BT-474细胞等为主要细胞模型，并通过lentivirus介导的shRNA抑制或过表达E-cadherin在这些细胞系中分别诱导或抑制EMT表型。比较不同细胞系在EMT前后其基因表达谱变化，用MeDIP-seq法比较基因组范围内DNA甲基化变化情况，并用ChIP-seq法比较与转录相关的主要的组蛋白修饰标志如激活性的组蛋白乙酰化、H3K4甲基化，抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化等在全基因组范围内的分布变化规律。在此基础上，对差异表达的新

13、基因及特异性组蛋白修饰酶在EMT以及在乳腺癌转移及药物耐受中的作用做深入分析。同时，选取两种以上高转移性细胞系，以TGFb或TNFa刺激细胞或稳定转染b-catenin分别激活TGFb、NFkB以及Wnt信号通路诱导EMT。用基因表达谱、蛋白质谱及全蛋白磷酸化谱分析在三种条件下共同变化的靶基因及蛋白分子。这些共同通路分子是各信号通路间的交互作用节点及潜在的EMT关键调控因子，对它们的作用机理进行进一步细胞及分子水平上的分析。建立可诱导表达荧光标记的E-cadherin或其它EMT诱导因子的稳定转染细胞系，以在细胞及分子水平上实时观察细胞内外环境的改变对EMT及细胞转移能力的影响。总体研究方案如

14、下：上皮间质转换的机理及表观遗传机制建立低转移性、高转移性乳腺癌细胞系及人工改变E-cadherin水平诱导或抑制EMT后的细胞系以TGFb或TNFa刺激细胞或稳定转染b-catenin分别诱导癌细胞发生EMTMeDIP-seq检测DNA甲基化变化ChIP-seq检测主要转录相关组蛋白修饰基因表达谱差异磷酸化修饰蛋白质组学差异蛋白质谱差异差异表达基因总体特征分析病毒介导的稳定过表达及shRNA抑制候选基因后，细胞表型及小鼠乳腺癌转移模型的行为变化功能域分析；质谱检测并验证相互作用蛋白；靶基因检测；与已知EMT基因关系新基因功能分析及特异性组蛋白修饰酶在EMT中的作用寻找高转移性乳腺癌及对现有化

15、疗药物不敏感性的乳腺癌的治疗靶点课题负责人：尚永丰，北京大学医学部学术骨干：梁静，北京大学医学部张华，中国航天员科研训练中心课题五：细胞微环境与肿瘤的发生发展及侵袭转移以乳腺癌为模型，分别从肿瘤细胞微环境中的肿瘤相关成纤维细胞、浸润的免疫细胞（肿瘤相关性巨噬细胞）和基质分子（细胞因子TGF）入手，研究肿瘤微环境对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响。分离乳腺良性增生患者及各种不同类型不同分期的乳腺癌患者组织微环境中的成纤维细胞及肿瘤相关性巨噬细胞，分析miRNA及mRNA的表达谱；研究这些差异表达的基因或miRNA对成纤维细胞及肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；建立三维细胞培养模型，将肿瘤细胞与基

16、质细胞共培养，尽量模拟体内环境，并应用免疫分子及免疫细胞缺陷小鼠构建小鼠骨髓嵌合体动物模型，研究这些差异表达的基因或miRNA对共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；采用基因工程小鼠模型，从分子、细胞、动物三个层面研究TGF信号通路在肿瘤微环境中与REGg蛋白酶体激活因子、p53等重要肿瘤因子动态相互作用及其动态调控的分子机制。在解析这些调控机制的生理病理意义的基础上，通过肿瘤模型研究进一步阐明肿瘤微环境中重要生物学因子对肿瘤发生发展的决定性作用。具体方案如下： mRNA及miRNA表达谱分析正常乳腺组织及不同类型的乳腺癌组织建立基质细胞与肿瘤细胞的三维细胞培养模型明确基质细胞的基因/miRNA

17、对肿瘤转移的影响肿瘤相关成纤维细胞原代培养TGF信号通路/REGg-蛋白酶体动物水平Smad2亚等位基因表达小鼠模型阐明REGg-蛋白酶体与TGF信号通路间的相互作用细胞微环境与肿瘤发生发展及侵袭转移基质细胞、细胞因子在肿瘤发生发展中的作用分子、细胞水平基因/miRNA的功能研究基因敲除建立肿瘤与细胞微环境网络体系肿瘤相关性巨噬细胞免疫缺陷小鼠骨髓嵌合体动物模型构建 课题负责人：刘芝华，中国医学科学院肿瘤研究所学术骨干：李晓涛，华东师范大学生命科学研究所曲春枫，中国医学科学院肿瘤研究所课题六：恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的分子调控网络利用肿瘤基因表达和表观遗传学数据，采用计算生物学方法推测在恶性

18、肿瘤、干细胞中发生变化的表观遗传学调控网络。为了更深入地研究肿瘤发生发展过程的分子调控网络，还需要从以下几个方面进一步发展基于贝叶斯网络的因果推断方法。（1）考虑到实验方法与手段的多样性，需要开发能够自动整合并利用多个异质实验数据的因果推断方法。这部分工作涉及去除反映单个数据源自身特征的背景信号，子网络的拼接与集成，观测型实验数据与(基因敲除、RNA沉默等)干预型实验数据的因果信息集成等多个问题；（2）通过开发根据数据特征自适应地调整网络正则化参数的学习算法等方式，以解决如何在具有较高噪声和不精确性的系统生物学实验数据中进行可靠因果推断的实际问题。对于大规模因果推断问题，使用现有的贝叶斯因果推

19、断方法，还面临有限的数据资源与急剧增大的网络搜索空间的矛盾。为了保证学习结果的鲁棒性，我们拟开发一系列能保持因果关系的特征选择方法来解决这个问题。（3）不同系统生物学因素之间的上下游作用关系可能会随肿瘤发生与发展的过程而动态地发生变化，为此我们拟开发能够正确推断这种动态关系的贝叶斯网络学习算法。因为肿瘤细胞有很多具有干细胞特性，且目前所掌握的胚胎干细胞数据比肿瘤数据更丰富也更系统,我们将在恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络，并进一步比较其异同。通过干扰预测的上游调控节点后以ChIP-PCR和ChIP-seq技术对下游节点进行检测，对以上预测模型中的关键调控关系进行验证。为了通过实

20、验验证贝叶斯网络模型推测出来的因果关系，我们将把它们作为遗传学的上下游关系处理。这样就可以人为地提高或降低上游事件的水平，例如，转录因子结合或者其他组蛋白修饰水平，而后观察下游事件，如基因表达，或者组蛋白或DNA修饰的水平的变化，来证实我们所预测的因果关系。以组蛋白甲基化修饰作用为例，甲基化转移酶和去甲基化酶是可用于干扰网络中的特定节点。譬如我们要证实H3K27me3抑制基因表达这一关系，我们可以通过抑制正常细胞或者癌细胞的组蛋白甲基化转移酶或者去甲基化酶来调节H3K27me3水平，从而观察下游基因表达水平的变化（图2）。实际上，一些已报道的因果关系正是利用上述方法和遗传突变在模式生物或细胞实

21、验中发现的。验证转录因子对某种组蛋白修饰的作用可以通过过表达或者RNAi转录因子来直接观察到。我们将通过过表达或者RNAi 分别上调或者下调转录因子，然后利用ChIP-qPCR技术检测一些已知的修饰位点或者利用ChIP-seq技术在全基因水平检测转录因子对全基因组范围内组蛋白修饰的影响。图2：如何通过干扰上游调控节点并以ChIP-PCR和ChIP-seq技术检测下游基因验证预测模型中的关键调控关系具体方案如下：染色质与组蛋白的多种表观遗传学修饰关键转录因子与基因的调控关系转录因子的ChIP-seq实验基因表达谱差异分析染色质构型分析表观遗传因子ChIP-seq实验绝缘子的基因组分布表观遗传因子

22、的基因组分布转录因子的目标基因分布染色质空间形态与DNA、组蛋白修饰的因果调控网络关键转录因子与目标基因的调控网络多因素SNP与GWAS分析：鉴定肿瘤发病相关的重要基因突变相互关系恶性肿瘤发病因素预测的因果网络模型RNAi与基因敲除研究：验证肿瘤发病相关转录因子与基因的影响范围恶性肿瘤高通量数据的整合与网络的计算预测课题负责人：韩敬东，中国科学院遗传与发育生物学研究所学术骨干：吴旻，武汉大学生命科学学院四、年度计划研究内容预期目标第一年1） 多种手段研究肺癌细胞肿瘤抑制基因甲基化状况，开展肿瘤转移相关DNA甲基化标志物研究；开展PcG蛋白表达变异与肿瘤抑制基因表观遗传失活关系研究；2） 利用高

23、通量芯片、ChIP-Chip、ChIP-seq、酵母双杂交、免疫沉淀结合质谱等技术，针对TGF和雌激素信号通路相关因子，如转录因子Smad4、ER及其转录辅助因子，筛选新的组蛋白修饰基因或miRNA；3） 利用RNA-SELEX-seq等技术平台系统筛选鉴定与肿瘤相关蛋白相互作用的ncRNA；检测ncRNA的表达谱； 4） 诱导或抑制EMT表型。比较不同细胞系在EMT前后其基因表达谱变化，用MeDIP-seq法比较基因组范围内DNA甲基化变化情况，并用ChIP-seq法比较与转录相关的主要的组蛋白修饰标志如激活性的组蛋白乙酰化、H3K4甲基化，抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化等在

24、全基因组范围内的分布变化规律。5） 分离乳腺良性增生患者及乳腺癌患者微环境中的成纤维细胞、浸润巨噬细胞、浸润的单核巨噬细胞，分析miRNA及mRNA的表达谱，研究不同类型的乳腺癌以及不同侵袭转移能力的乳腺癌中上皮细胞与间质细胞的表达谱差异；6） 开发能够自动整合并利用多个异质实验数据的因果推断方法。包括去除反映单个数据源自身特征的背景信号，子网络的拼接与集成，观测型实验数据与(基因敲除、RNA沉默等)干预型实验数据的因果信息集成等多个问题。1） 找出有代表性的肿瘤抑制基因，分析甲基化谱，筛选出一组肿瘤转移相关DNA甲基化标志物；掌握肿瘤组织中多种PcG蛋白表达变异规律；2） 获得新的组蛋白修饰

25、组分；3） 筛选出一批肿瘤相关的ncRNA；并确定ncRNA及相关蛋白的表达谱；4） 优化EMT表型诱导条件，完成基因表达谱及MeDIP-seq，ChIP-seq法比较DNA甲基化及主要组蛋白修饰谱变化实验；5） 发现与肿瘤发生发展和转移相关的不同间质细胞的表型特征，以及一些重要的免疫相关蛋白、间质细胞中miRNA及mRNA的表达改变；6） 建立能够自动整合并利用多个异质实验数据，适用于大规模高噪声的组学数据的因果推断方法，并开发为计算软件。第二年1） 分析围绕甲基化基因启动子周围的组蛋白修饰状况，开展核小体在DNA甲基化扩展过程中的作用研究；开展肿瘤转移相关甲基化标志物多中心验证研究；2）

26、利用免疫共沉淀、GST pull-down、细胞内共定位等蛋白质间相互作用技术验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用，定位相互作用的结构域/区域。3） 研究筛选到的ncRNA与蛋白质、DNA或RNA等生物大分子的相互作用；4） 对克隆得到的新的潜在EMT调控因子用分子生物学及细胞生物学的手段进行功能分析；5） 通过基因过表达或敲降的方法，研究差异表达的基因或miRNA对成纤维细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞的生物学行为的影响，尤其是肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；6） 对于大规模因果推断问题，使用现有的贝叶斯因果推断方法，还面临有限的数据资源与急剧增大的网络搜索空间的矛盾。为了保证学习结果的鲁

27、棒性，我们拟开发一系列能保持因果关系的特征选择方法来解决这个问题。1） 探明组蛋白修饰与甲基化DNA之间的关联性，证明核小体在DNA甲基化扩展过程中的作用；2） 明确组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用及其相互作用方式；3） 初步确定ncRNA的作用靶点，特别是与蛋白的相互作用；4） 发现一些新的潜在EMT调控因子；5） 发现几个间质细胞来源的与肿瘤发生发展和转移密切相关的新的分子；6） 建立能够自动进行因果关系的特征选择方法，并开发为计算软件。探索推断肿瘤发生与发展动态关系的方法；7） 发表5-6篇IF5的研究论文,1-2篇IF10的研究论文。申请专利1-2项。第三年1） 研究影响DNA甲基

28、化和组蛋白修饰的关键酶，找出连接甲基化与组蛋白的蛋白。在不同病变人体组织中肿瘤转移相关基因DNA甲基化形成、扩展和维持规律研究；2） 利用基因过量表达和敲低/敲除技术、组蛋白修饰等分析技术检测组蛋白修饰因子对组蛋白修饰的影响及不同修饰间的相互影响。检测组蛋白修饰候选因子对TGF、雌激素信号通路等相关的下游靶基因表达的影响。确定组蛋白修饰复合物中各成员间物理上的相互作用与功能上的相互作用的关系；3） 研究ncRNA在表观遗传修饰和转录水平上对基因转录的调控作用；以及ncRNA相关的信号调控通路；4） 对克隆得到的新的潜在EMT调控因子用分子生物学及细胞生物学的手段进行功能分析；5） 发展三维细胞

29、培养模式，将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体内环境，研究这些差异表达的基因或miRNA对共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影响，探讨改变细胞微环境对肿瘤侵袭转移的影响；6） 在恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络,并进一步比较其异同。进一步通过自动文献检索来检验网络的准确性。1） 初步论证连接DNA甲基化与组蛋白修饰的关键蛋白和酶。联系得到一组能够准确预测肿瘤转移能力的DNA甲基化标志物；2） 明确组蛋白修饰候选因子对组蛋白修饰和基因表达的影响；3） 发现肿瘤相关蛋白与ncRNA间相互作用对基因转录的调控作用及具体的分子机制；4） 建立单核巨噬细胞特定基因敲除或过表达的小鼠乳腺癌模

30、型；5） 发现恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络,的异同；6） 发表5-6篇IF5的研究论文,1-2篇IF10的研究论文。申请专利1-2项。第四年1） 研究DNA甲基化与组蛋白修饰的先后及其相互影响的机制，开展肿瘤转移相关甲基化标志物生物学功能基础研究；2） 以过量表达、RNA干扰和染色体免疫沉淀等技术手段增加或者降低组蛋白修饰候选因子在细胞内的含量，检测候选因子对组蛋白修饰复合物中各成分的转录和蛋白质稳定性的影响、对组蛋白修饰酶在靶基因序列上募集的影响和对组蛋白修饰酶活性的影响；3） 利用细胞模型和裸鼠动物模型系统研究ncRNA在肿瘤发生发展中的作用；4） 继续进行EMT相关新

31、基因功能分析，并根据分子生物学的研究成果，建立必要的动物模型，研究新的EMT调控分子过表达或基因敲除后对乳腺癌转移的影响；5） 利用小鼠骨髓嵌合体和乳腺癌动物模型，研究肿瘤相关间质细胞对肿瘤细胞的发展与转移能力的影响。继续研究化学致癌剂在肿瘤易发及对照小鼠中诱导特定的癌症模型并研究其病理生理特征以及相关分子机制。原位ATC肿瘤异种移植模型的肿瘤转移机制研究；6） 通过干扰预测的上游调控节点后以ChIP-PCR和ChIP-seq技术对下游节点进行检测，对贝叶斯网络模型推测出的关键调控关系进行验证。1） 确定影响DNA甲基化与组蛋白修饰的蛋白作用机制，确定DNA甲基化标志物影响肿瘤转移相关的机制；

32、2） 确定组蛋白修饰候选因子在基因表达调控中的分子机制；3） 发现肿瘤相关蛋白与ncRNA间的相互作用在细胞生长、分化、肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用；4） 原位ATC肿瘤异种移植模型的肿瘤转移机制研究取得重大进展；5） 验证并估算得到贝叶斯网络的预测准确性；6） 发表5-6篇IF5的研究论文,1-2篇IF10的研究论文。申请专利1-2项。第五年1） 探讨表观遗传调控的新机制，建立测定肿瘤转移能力的DNA甲基化分型；进行DNA甲基化标志物诊断试剂盒开发；2） 利用基因过量表达和敲低/敲除技术，在体外细胞水平和体内小鼠肿瘤模型中检测筛选到的候选分子对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、转移以及EMT的影响

33、，检测候选分子对细胞恶性转化的能力。利用小鼠基因敲除模型，检测组蛋白修饰因子及其调节的靶分子在体内组织水平上的改变模式，利用免疫组织化学等技术检测某些候选分子及相应的组蛋白修饰在肿瘤发生发展及侵袭转移中的临床意义；3） 系统深入地研究ncRNA和蛋白间的相互作用、它们所构成的结构网络、调控网络、以及这些相互作用的生理功能，剖析ncRNA调控网络在肿瘤发生发展进程中的作用与意义；4） 继续进行功能分析实验，并在乳腺癌肿瘤病人标本中验证研究所得的EMT关键分子与肿瘤治疗反应及预后的关系，筛选有诊断意义的分子标志；5） 通过体内外实验，阐明在肿瘤微环境中，促进单核细胞浸润和分化发育成为不同类型巨噬细

34、胞的调控因素，及不同微环境下不同的巨噬细胞亚群影响乳腺细胞以及乳腺肿瘤细胞增殖和行为特征机制；6） 利用ChIP-seq技术在全基因水平检测转录因子对全基因组范围内组蛋白修饰的影响。并在加入新的ChIP-seq数据后重建并改进贝叶斯网络模型。1） 开发出1-2个预测肿瘤转移能力的DNA甲基化标志物诊断试剂盒；2） 确定组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用；3） 提出ncRNA作用机制的新假说，探讨在细胞中是否存在一个通过RNA-蛋白相互作用而构成的结构网络和信息调控网络。为肿瘤诊断与治疗提供新的理论基础和ncRNA分子靶标；4） 筛选出1-2个对乳腺癌治疗及预后具有诊断意义的分子

35、标志；5） 阐述在肿瘤微环境中，间质细胞及分子对肿瘤发生发展及侵袭转移影响及作用的分子机制，从间质细胞角度寻找阻断肿瘤侵袭转移的靶分子；6） 进一步验证并估算贝叶斯网络的预测准确性。并基于新的ChIP-seq数据得到改进的贝叶斯网络模型。7） 发表5-6篇IF5的研究论文,1-2篇IF10的研究论文,申请专利1-2项。一、研究内容主要研究内容1、 表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和获得多能“干性”方面发挥关键性作用，也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭/转移能力的物质基础。本项目拟在开展转移相关DNA甲基化组学研究的基础上，筛选并鉴定出影响乳腺癌细胞转移能力的关键性DNA甲基化变化位点及其网络

36、，了解其在乳腺癌细胞获得转移能力重编程过程中作用，建立预测乳腺癌等恶性肿瘤转移能力的表观遗传分子分型体系。以肿瘤高甲基化基因1（Hic1）为目标，以III类组蛋白去乙酰化酶SIRT1为对象，探讨SIRT1作为组蛋白去乙酰化酶对组蛋白修饰及其对DNA甲基化酶和DNA结合蛋白相关因子的作用，筛选影响DNA甲基化酶和DNA结合蛋白的关键性因子；明确相关关键性因子与DNA甲基化酶和DNA结合蛋白作用的分子机制，进一步阐明Hic1基因发生DNA甲基化的分子机制，进而揭示组蛋白修饰和DNA甲基化的相互作用关系。探讨逆转DNA甲基化在肿瘤治疗中的临床应用价值，在明确“肿瘤组织DNA异常甲基化-基因表达变异-

37、肿瘤细胞转移功能”关系的基础上，确定乳腺癌和肺癌转移能力的关键性DNA甲基化变异位点及其网络，建立肿瘤转移能力的DNA甲基化分型体系，并结合大样本肿瘤患者随访以及模式动物进行验证研究。2、 探讨组蛋白修饰如何影响基因的转录及这种调控形式如何影响恶性肿瘤发生发展及侵袭转移。包括新的组蛋白修饰复合物的发现和作用机制的探讨；研究不同组蛋白修饰之间的相互影响，特定的组蛋白修饰与特定的基因转录激活或抑制的关系，组蛋白修饰和转录因子/转录辅助因子的组装，组蛋白修饰复合物的调控，组蛋白修饰在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用和机制；筛选组蛋白修饰复合物成分，包括MLL1等相关的甲基化酶复合物成分、组蛋白磷酸化酶

38、、TGF和雌激素信号途径相关的组蛋白修饰因子等；验证组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用；检测分离的组蛋白修饰因子对组蛋白修饰的影响及不同修饰间的相互影响；检测组蛋白修饰因子对靶基因的选择性和表达的影响，以及组蛋白修饰对Smad、ER等转录因子募集到靶基因启动子上的作用；在细胞水平和小鼠肿瘤模型中检测筛选到的候选分子在乳腺癌、肺癌等肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用和机制；收集大量临床标本，结合病理及预后等资料，检测几个候选分子及相应的组蛋白修饰在乳腺癌、肺癌等肿瘤发生发展及侵袭转移中的临床意义。3、 利用课题组前期工作中建立的筛选与目标蛋白相互作用的ncRNA的技术平台（RNA-SELEX-se

39、q），从肿瘤细胞系和肿瘤组织中筛选鉴定与肿瘤相关蛋白相互作用的ncRNA，研究ncRNA-蛋白质间相互作用的分子基础、动态时空关系以及功能调控网络；阐明ncRNA在表观遗传修饰和转录水平上对基因转录的调控作用，深入探讨它们在肿瘤发生发展及侵袭转移中的意义；利用生物信息学和实验相结合的方法鉴定以ncRNA为轴心，与之相互作用的蛋白质、RNA和DNA，发现ncRNA新的作用机制，探讨在细胞中是否存在一个通过RNA-蛋白相互作用而构成的结构网络和信息调控网络；在发现和鉴定的肿瘤特异性ncRNA及其相关蛋白的基础上，用肿瘤启动细胞模型、肿瘤转移模型（包括肿瘤细胞EMT模型）以及临床标本，深入探索具有临

40、床意义的ncRNA及其相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用。4、 寻找新的EMT调控因子以及新的EMT相关调控通路，研究建立和维持EMT的信号通路之间的交互作用：一般来说，ER阳性的乳腺癌细胞（如MCF-7细胞）转移性弱，而ER阴性的乳腺癌细胞（如MDA-MB-231细胞）转移性强。癌细胞ER表达阳性也是其对三苯氧胺等雌激素拮抗疗法有反应性的前提条件。但三苯氧胺对部分ER阳性的乳腺癌细胞治疗效果较差。选取正常乳腺癌细胞、乳腺癌低转移性、高转移性、耐药性的代表细胞系进行表达谱分析，检测它们是否具有EMT相关基因的表达差异。其中差异表达的除已知EMT基因外，未知功能的基因表达产物根据其功能域及蛋白质组学

41、分析（如质谱检测其相互作用蛋白等方法）可研究其是否为新的EMT相关转录因子。基因表达谱差异分析可同样应用于以lentivirus在低转移性细胞用shRNA抑制E-cadherin促进其EMT，或高转移性细胞引入E-cadherin表达后与原有细胞的对比研究中。已发现多种信号通路都与EMT相关。拟选取目前研究较为充分的TGFb通路，以及Wnt和NFkB通路为代表，分别给予乳腺癌细胞相关信号分子刺激诱导EMT，随后进行基因表达谱、通路特异性蛋白质谱以及高通量的细胞内磷酸化修饰改变等分析，找到这些通路在EMT过程中的共同靶点并阐明其在EMT中如何扮演关键角色。建立可诱导表达荧光标记的E-cadher

42、in或其它EMT诱导因子的稳定转染细胞系，以在细胞及分子水平上实时观察细胞内外环境的改变对EMT及细胞转移能力的影响。同时，研究这些分子及相关的通路与乳腺癌病人的转移、疗效、预后及药物敏感性的关系，探讨其临床应用价值。5、 EMT过程中DNA甲基化水平和组蛋白修饰在全基因组范围内的改变及特异的组蛋白修饰酶如何参与调控EMT：EMT是已分化上皮细胞进行基因表达重编程的生物学行为，势必有DNA甲基化及多种影响基因转录的组蛋白修饰在全基因组范围内重新分布。利用MeDIP-seq检测细胞在发生EMT时在全基因组范围内的DNA甲基化变化规律。同时，针对特异性组蛋白化学修饰如转录激活性的组蛋白乙酰化、H3

43、K4甲基化，转录抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化等，利用其特异性抗体进行ChIP-seq分析，检测细胞发生EMT时的组蛋白化学修饰变化规律。从以上两方面的研究出发，进而对潜在EMT关键基因进行详细的生物学功能研究。特异的组蛋白修饰酶可能在EMT调控中扮演关键角色。组蛋白H3K27三甲基化酶EZH2在乳腺癌中显著高表达，并与远处转移及较差预后密切相关，提示其在EMT中亦可能扮演关键角色。相关课题组之前发现组蛋白H3K4去甲基化酶LSD1在TGFb信号通路及乳腺癌转移中起重要作用。课题将进一步以EZH2及LSD1为研究对象，通过基因组学及质谱分析，研究它们和已知的EMT相关的转录因子

44、之间的相互关系。6、 分离乳腺良性增生患者及乳腺癌患者微环境中的成纤维细胞，进行原代培养后，分析miRNA及mRNA的表达谱，研究不同类型的乳腺癌（基底型、导管A型、导管B型、HER2+/ER-型、类正常乳腺型），以及不同侵袭转移能力（高转移、不转移）的乳腺癌中上皮细胞与间质细胞的表达谱差异；通过基因过表达或敲降的方法，研究这些差异表达的基因或miRNA对成纤维细胞及肿瘤细胞的生物学行为的影响，尤其是肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；发展三维细胞培养模式，将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体内环境，研究这些差异表达的基因或miRNA对共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影响，探讨改变细胞微环境对肿瘤侵袭

45、转移的影响。7、 从髓系细胞在不同病理状态下的乳腺组织中的浸润和群体变化入手，通过分析乳腺良性增生患者、乳腺癌组织的局部微环境中，浸润性的髓系细胞（包括浸润的肿瘤相关性巨噬细胞）的活化和表型特征，特异性表达基因的改变，分析在乳腺癌发生的微环境中，促进单核细胞浸润和分化发育成为M2型肿瘤相关性巨噬细胞的调控因素，探寻促进乳腺细胞异常增殖分化的免疫细胞的相关因素和分子及其调控因素；在我们已经建立的三维模拟人体体外免疫系统模型基础上，改进并建立起进行乳腺癌细胞/静脉血管内皮细胞/免疫细胞的共培养的三维模型；通过活化髓系细胞，以及体外分化的M2型巨噬细胞，研究免疫细胞中的异常表达基因和分子对良性增生的

46、乳腺细胞以及乳腺肿瘤细胞增殖和行为特征的影响；并采用具有不同行为特征的肿瘤细胞以及在肿瘤细胞中采用基因过表达或敲除的方法，研究探讨其对浸润的免疫细胞分化的影响；通过制备同类系小鼠骨髓嵌合体，进而在乳腺癌小鼠动物模型中，确证相关免疫的细胞活化因子在促进肿瘤细胞侵袭转移中的作用，并探讨肿瘤细胞产物对髓系抑制性细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）产生的机制以及可能的阻断途径，从而在机体免疫水平探讨阻断肿瘤侵袭转移的策略。8、 采用基因工程小鼠模型，研究TGF信号通路在肿瘤微环境中与REGg蛋白酶体激活因子、p53等重要肿瘤因子动态相互作用及其动态调控

47、的分子机制；在解析这些调控机制的生理病理意义的基础上，通过肿瘤模型研究进一步阐明肿瘤微环境中重要生物学因子对肿瘤发生发展的决定性作用；以正常细胞和肿瘤细胞为模型，利用基因敲除等手段，近一步阐明REGg蛋白酶体与TGF信号通路间的相互调节以及信号反馈机制；利用正常表达及缺失REGg的小鼠（C57BL/6遗传背景的REGg+/+和REGg-/-小鼠），通过杂交建立Smad2亚等位基因表达（hypomorphic expression）的小鼠模型，用化学致癌剂在肿瘤易发及对照小鼠中诱导特定的癌症模型，通过对癌症发生的普遍特征、肿瘤病理组织学分析等研究来探讨TGF信号通路与REGg蛋白酶体的交互作用。9、 利用肿瘤基因表达和表观遗传学数据，采用计算生物学方法推测在恶性肿瘤、干细胞中发生变化的表观遗传学调控网络。进一步发展基于贝叶斯网络的因果推断方法。在恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络,并进一