Abbkine免疫(共)沉淀磁珠-琼脂糖实验步骤.docx

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1、Abbkine I免疫(共)沉淀磁珠/琼脂糖实验步骤免疫沉淀(IP)是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行小 型亲和纯化的方法。需要从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋 白和其他生物分子时，免疫沉淀是常用的方法之一。接下来就和abbkine一起分享一下免疫 (共)沉淀磁珠/免疫(共)沉淀琼脂糖的相关问题。什么是免疫共沉淀？免疫共沉淀的优缺点是什么？免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究 蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质具有生理性相互作用的有效方法。优点：相互作用的蛋白质都

2、是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物；能够对间接相互作用的蛋白进行捕获，比如对蛋白复合物的多种成分进行鉴定；可以研究具有修饰的目的蛋白；操作流程较为简便，不需要事先制备大规模蛋白表达文库。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用；不能判断直接互作还是间接互作，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在 中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择特异的检测抗体，若预测不正确，实验就得不到 结果，方法本身具有冒险性；灵敏度没有亲和色谱高；可能因为多种非特异性吸附带来假阳性

3、结果，因此需要设置严格的对照。免疫共沉淀(Co-IP)具体实验方法免疫共沉淀的大致流程如下：准备蛋白样品-抗原抗体结合-proteinA/G与抗体结合-免疫共沉淀分离-WB/MS分析出报告免疫共沉淀的具体操作步骤如下：取20 u L的Protein A/G Magnetic Beads加入到1.5mL离心管中，离心管置于磁分离架上, 静置10s,吸弃上清。(2)加入ImLIX Wash Buffer,重悬Protein A/G Magnetic Beads,离心管置于磁分离架上,静 置10s,吸弃上清，重复3次。加入0.2-2 u g抗体溶液，重悬Protein A/G Magnetic Be

4、ads,室温下置于垂直旋转混合仪孵 育30min,离心管置于磁分离架上，静置10s,收集上清液，沉淀用于后续Step(4)。可选做， IgG 阴性对照：加入 0.2-2 u LMouselgG 或 Rabbit IgG,重悬 Protein A/G Magnetic Beads,室温 下置于垂直旋转混合仪孵育30min,离心管置于磁分离架上，静置10s,收集上清液，沉淀 用于后续Step（4）。此步可排除IgG本身和目的蛋白或其它特定生物分子的非特异性结合。注 意：Protein A/G Magnetic Beads置于垂直旋转混合仪混匀时，要保证有一定的流动性，若不 流动，加入一定量的IX

5、Wash Buffero加入ImLIX Wash Buffer,重悬Protein A/G Magnetic Beads,离心管置于磁分离架上，静 置10s,吸弃上清，重复3次。（5）加入0.2-lmL （0.2.lmg）蛋白样品或上清（去除非特异性结合蛋白的上清），在室温下置于 垂直旋转混合仪孵育lh或4c过夜。离心管置于磁分离架上，静置10s,收集上清液，沉淀用于后续Step（7）。加入ImLIX Wash Buffer,重悬Protein A/G Magnetic Beads,离心管置于磁分离架上,静 置10s,吸弃上清，重复3次。洗脱a）变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAG

6、E和Western Blotting检测。向离心管中 力口入 20-50 u L1XSDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀，100力口热 5min,然后进行离心，800rpm 离心lmin,收集上清液,进行SDS-PAGE和Western Blotting检测分析。b）非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心 管中力II入20-50 uLEIutionBuffer混匀，然后在室温下孵育10min, 800rpm, 4,离心2min, 收集上清液至新的离心管中，并立即加入1/lOEIutionBuffer体积的Neutralization B

7、uffer,将 洗脱组分pH调节至7.0-8.0,用于后续功能分析。免疫（共）沉淀磁珠/免疫（共）沉淀琼脂糖相关研究工具如下：1、通用型免疫（共）沉淀（IP/Co-IP）工具箱（磁珠）2、通用型免疫（共）沉淀（IP/Co-IP）工具箱（琼脂糖）工KU姐分试剂盒如分册格(20 T)*存条件Univefsai IP/ColPIbottut (MagneticBeads) (Parti of 2)Non-Denatunng Lysis Buffer25 mL4XDenatunng Lys4s Buffer25 mL4X20 Wash Buffer20 mL4XProtein A/G Magnetic Beads0 45 mL4XElution Buffer2 mL4XHeutraUation Buffer0.2 mL4Xnivefsai IP/ColPIdoM (Magnetx:Bead$)(Pdr12o(2)100*Proeinase Inhibitor Cocktail02 mL20XMouse IgG (1mg/mL)30 pL-20XRabbft IgG (1mg/(nL)30 mL-20XIPKine HRR Goal AntnMouse IgG LCS30|iL-20X