威尼德方波与指数波电穿孔仪：感受态细胞的制备及各种转化方法.docx

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1、威尼德方波与指数波电穿孔仪：感受态细胞的制专业专注专研专业专注专研备及各种转化方法致力于生命科学仪器的研发和生产COWMlTTfO TO THE DfVFlOPVfMT AND PtODUCHON OF1大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCL法)(1)从新活化的E.coli DH5a菌平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中， 37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液 体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次 OD600nm,至 OD600nms0.5 时停止培养；(2)每组取培养液3个2ml转入

2、2ml离心管中，在冰上冷却20-30min,于4, 4000r /min离心10min (从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳)；(3)倒净上清培养液，用1ml冰冷的O.lmol/LCaCb溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；(4) 04, 4000r / min 离心 10min；(5)弃去上清液，加入500M冰冷的O.lmol /L CaCb溶液，小心悬浮细胞。04, 4000r / min 离心 10min；(6)弃去上清液，加入100日1冰冷的O.lmol/LCaCb溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片 刻后，即制成了感受态细胞悬液；(7)制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入

3、占总体积15%左右高压灭 菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。2细胞转化(1)分别取3个100口1感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，那么需化冻后马上进行下面 的操作)，第一组，加入10口1重组质粒DNA(体积不超过10日1) IOOrI感受态细胞，此管为转 化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ngiOOpd感受态细胞悬 液；第三组，质粒DNA对照组，即Ing未酶切pBluescript质粒DNA十lOOjal感受态细胞 悬液。(2)将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min,于42c水浴中保温12min,然后迅速冰上冷却2

4、min威尼德生物科技(北京)(),研发生产的 双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性， 从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核甘酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以 及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价 值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。(3)立即向上述管中分别加入0.4mlLB液体培养基(不需在冰上操作)，使总体积到0.5mL 该溶液称为转化反响原液，摇匀后于37振荡培养约45-60min ,使受体菌恢复正常生长状 态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。

5、3平板培养(有时需要稀释)(1)取各样品培养液0.1ml,分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀(如果用玻璃 棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫)。(2)菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37c恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)， 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时 应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用CaCL法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质 粒DNA产生5xl()6_2xl07个转化菌落。在实际工作中，每微克有1()5以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。74)检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿

6、内菌落生长状况应如表所示：各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析威尼德生物科技(北京) (),研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电 场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核甘酸、 DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其 它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的 各类细胞电穿孔。组含抗菌素的平板结果说明转化实验蛆白色菌落和少量蓝色菌落说明有重蛆质粒导入细胞中（有时还 需要甑切进一步鉴定）插入DNg段对照组无菌落或极少量白色菌落说明插入片段比拟纯或有少量模板DAN存在质粒对照组蓝色菌落可以判断感受态细胞的效率转化体总数=菌落数X （转化反响原液总体积/涂板菌液体积）插入频率=蓝色菌落数/白色菌落数转化频率=转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）