产淀粉酶菌种的分离.docx

《产淀粉酶菌种的分离.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《产淀粉酶菌种的分离.docx（6页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、产淀粉酶菌种的分别、筛选、鉴定和产酶条件优化一.设计背景淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商 业价值的重要酶类。是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。 所以开头产淀粉酶菌种的分别、筛选、鉴定和产酶条件优化。二.目的要求分别筛选出产淀粉酶菌种，并进行鉴定和产酶条件的优化三.试验技术步骤及具体流程采集含菌样品 设计配制选择性培育基 分装灭菌 平板涂布分别 纯化菌种（透亮 一命） 划线分别进一步纯化产酶菌种（透亮 圈 法） 液体培育渚复筛产酶菌葩嘘测产酶性能 目的菌和福和甘油保藏 目的菌种的染色法显微旋看 ） 目的菌种的常规生理生逸定

2、考察紫外线对 产酶菌种生长/产酶性能的诱变效应 考察碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长 及产酶性能的影响 考察PH对产酶菌种生长及产酶性能的影响L采集含菌样品依据所选产酶菌种的要求，我们宜在淀粉制品霉变的样品中分别。故在新校区的花坛中 提前一周埋入淀粉制品（距离地表5cm左右），一周后用小铁勺在新校区的花坛中挖出泥 土，放入提前预备好的塑料袋中。2 .培育基的配制2.1 平板筛选培育基：牛肉膏0.5%,蛋白陈1.0%, NaCI 0.5%,可溶性淀粉2.0%,琼 脂 L 5-2. 0%, pH 自然。121灭菌 20min。2.2 摇瓶复筛培育基：玉米粉3%,玉米浆3%, CaCI2 0. 1

3、3%,Na2HP040. 3%,(NH4)2S040. 4%, pH 6. Oo 121灭菌 20min。2.3 斜面保存培育基：牛肉膏5.0g,蛋白陈10.0g, NaClS.Og,琼脂15.020.0g,加蒸 储水至 1000ml。2.4 种子培育基：牛肉膏5.0g,蛋白陈10.0g, NaCI5.0g,琼脂15.020.0g,加蒸储水 至 1000ml。2.5 产酶液体培育基：玉米粉3%,玉米浆3%, CaCI2 0. 13%,Na2HP040. 3%,(NH4)2S040. 4%, pH 6. Oo 121灭菌 20min。3 ,分装灭菌将所需要灭菌的仪器，如培育皿，锥形瓶，试管，移液

4、管灭菌，使用加压蒸汽灭菌法。 一般使温度上升到121摄氏度，高温加压20Mmin。4.平板涂布分别纯化菌种（透亮. 圈法）称取土壤样品1g溶于9mL无菌水中，将水样品5mL溶于45mL无菌水中，分别用无 菌水梯度稀释至IX 1（）7倍，取io5、1X10 1义1。7稀释液涂布于平板筛选培育基外表。 37摄氏度培育72h,用无菌的牙签选择单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。 影印过的培育川L 37培育72h,取其中一皿喷洒稀碘液纪录有水解圈的单菌落。依据纪录 从剩余2皿中挑取对应有透亮圈的单菌落，转接，经平板划线法得到纯种。接种斜面保存培育基中，培育后于4保藏。5,划线分别进一步纯化

5、产酶菌种（透亮 圈法）将初筛得到的菌种涂布于平板筛选培育基外表。依旧37摄氏度培育72h,用无菌的牙 签选择单菌落影印2.3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培育皿37C培育72h, 取其中一皿喷洒稀碘液纪录有水解圈的单菌落。挑取有透亮 圈的单菌落，转接, 经平板划线法得到纯种。通过复筛，划线分别进一步纯化产酶菌种，接种斜面保存培育基中, 培育后，于4冰箱保藏。6 .液体培育法复筛产酶菌种，检测产酶性能6.1 复筛得到的纯菌种接种于30 / 250mL种子培育基，37摄氏度、250r / min摇床培 育过夜。种子液以2%接种量接种于产酶液体培育基50 / 500mL,相同条件培育72h

6、,发酵液8 000r/min离心lOmin,取上清液测酶活，每个样品重复3次，最终结果取平均值。6.2 酶活测定方法测定方法：3, 5一二硝基水杨酸比色法。L标准梯度糖液配制，分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml 于16号试管中，并用蒸馈水补足到1ml。2.还原糖液的提取，精确称取样品1.0g于100ml 小烧杯中，再加入50ml蒸储水搅匀，用水定容到100ml。3.过滤，取滤液1ml于7、8号试 管中，待用。4.称取样品1.0g,放入100ml小烧杯中。加入10ml 6moi/L的HCI,和15ml 蒸储水，沸水浴加热25min.用胶头

7、滴管滴23滴碘化钾一碘溶液于培育皿中(可以略微稀 释)，用细玻璃棒 蘸少量样品与之进行反响，假设无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全, 否那么连续沸水浴加热并每隔5min以相同的方法再次测定，直至完全水解。5.取出完全水解 的样品，冷却后滴加23滴酚醐,用6moi/LNaOH滴定至中性。6.用水定容到100ml,过滤, 取5ml滤液，再次定容到100mlo 7.取6中其次次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。1.OD540的测量及标准曲线的制作，在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只 试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min,再流水冷却。2、每支试管加

8、入再4.0ml蒸储水并摇匀。3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其 OD540,以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。4、取16号试管中的数据, 做出OD540还原糖含量曲线，纵坐标为OD540,横坐 标为0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 单位mg。5、在曲线上读出710号试管的含量值。L计算.取7, 8号试管含量的平均值作为还原糖含量值，取9, 10号试管含量的平均值 作为总糖的含量值。2.还原糖含量二还原糖毫克数X样品稀释倍数(100)样品毫克数 (1000 ) X100%总糖含量=水解后还原糖毫克数义样品稀释倍数(2000)X0.9样品毫克

9、数(1000 ) X100%酶活力定义：在40摄氏度、pH 6.0, lmin从可溶性淀粉中释放 出lumol还原糖所需 的酶量。7 .目的菌种将筛选出的菌种接种到我们的斜面培育基或者用甘油保存。斜面保存培育基:牛肉膏5.0g,蛋白陈10.0g, NaCI5.0g,琼脂15.020.0g,加蒸储水至1000mlo 菌种甘油保存方法：1.将要保存菌种接种于LB液体培育至对数生长期（肉眼见培育 体系内浑浊即可），2 ,将甘油稀释至浓度为50% （等体积蒸储水加等体积甘油，甘油需要 渐渐吸），3 .将甘油、2 ml离心管、枪头等试验用品于121灭菌20min, 4 .无菌条件下 将菌液与50%浓度甘

10、油1:1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为25%, 5 .于-20C冰箱内 保存。8 .目的菌种的染色法显微观看（1）取目的菌种进行涂片、干燥、固定。涂片不宜过厚。（2）初染，滴加结晶紫以刚掩盖为宜，染色广2min,水洗。（3）媒染，用碘液冲去残水，并用碘液掩盖约lmin,水洗。（4）脱色，用滤纸吸去残水，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，马上 水洗。脱色时间一般约20-30so（5）复染，用0.5%番红溶液复染约2min,水洗。革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌那么 呈现红色。（6）镜检，用油镜观看。9 .目的菌种的常规生理生化鉴定9.1 糖发酵试验（1）取四支倒置了德汉氏小

11、管的试管，向其中分别加入无菌乳糖培育基、无菌葡萄糖培育 基、无菌蔗糖培育基、无菌麦芽糖培育基。（2）用记号笔在各试管外壁上分别做标记，以区分各培育基，并在培育基中加入指示剂（漠 甲酚紫）。（3）在四支试管中接种目的菌种，将接种后的试管放置于37c的温箱中培育24h48h。（4）观看各试管中颜色变化以及德汉氏小管中有无气泡。9.2 甲基红试验（MR试验）（1）菌种接种于葡萄糖蛋白陈水培育基中，置37c培育48-72h。（2）配置甲基红试剂（甲基红0. 02g, 95%酒精60mL,蒸储水40mL） , 20mg甲基红溶于60 mL95%乙醇中，然后加入40mL蒸储水。（3）取出后加甲基红试剂3-

12、5滴，马上观看结果。假如培育液呈红色者为阳性，橙色者为 可疑，黄色者为阴性。9.3 接触酶试验取干净载玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%达02 1滴，马上观看结果。9. 4硫化氢产生试验（1）取SIM培育基（胰腺20g、多价豚6g、硫酸铁镂2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂3. 5g） 30g,加热溶解1000ml蒸储水中，分装试管，121高压灭菌15分钟备用。（2）将目的菌种穿刺接种至培育基中。将全部试管置于37下培育24-48小时。（3）检视全部SIM培育基，观看接种线有无黑色产生，将纪录结果，推断目的菌是否具有 产生硫化氢之力量。再观看微生物是否沿接种线向四周集中，并推断其是否具运动性。10

13、.紫外线对特定产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应（1）菌种活化将目的菌接种到固体斜面培育基上，放入培育箱中于37c培育24h,即得活 化菌株。（2）菌悬液制备取活化后的菌种2环接种于盛有100ml无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃 珠，并置摇床上振荡20min,配成106-108个/mL的菌悬液。（3）紫外线诱变及筛选 各取5mL菌悬液移入18个无菌培育皿中，置于距30W紫外灯30cm 处的磁力搅拌器上照耀Imin,然后翻开皿盖并开启磁力搅拌器，分别照耀0s（比照用）、50s、 60s、70s、80s、90s、100s. 110s、120s（各做2组）。在暗光条件下，分别取经紫外线诱 变的菌悬液0.

14、 1mL涂布于18个固体鉴别培育基上，倒置于37。恒温培育箱中避光培育36h, 计算致死率。喷洒碘液后，选择单菌落变色圈直径与菌落直径比值H/C22. 0的菌株，进 行摇瓶发酵试验，测定其产酶力量。1L碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响11.1 最正确碳源确实定在500mL三角瓶中各装50 mL基础发酵培育基，其中的碳源分别为可溶性淀粉、玉米粉、 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖；设3个重复。接入种子液2 mL, 37, 180r/min培育4d, 测定粗酶液酶活。11.2 最正确氮源确实定在500mL三角瓶中各装50位基础发酵培育基，氮源分别为牛肉膏、蛋白豚、酵母粉、玉 米浆、大豆

15、粉、硫酸铉、蛋白陈10 g/L +酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L +蛋白陈5 g/L；设 3个重复，接入种子液2 mL, 37, 180r/min培育4d,测定粗酶液酶活。12.pH值对产酶菌种生长及产酶性能的影响在500nli的三角瓶内装基础培育基50 mL,加缓冲液调整至不同的pH值(4、5、6、7、8、 9),灭菌冷却后接种子液0.5mL, 37。恒温培育4d,取样测定产酶菌的生长状况和淀粉酶酶 活。四.试验所需仪器设施和耗材水平摇床，电热恒温水浴锅，压力蒸汽灭菌器，台式离心机，754紫外可见分光光度计, PH计，电子精密天平，高速离心机，烘箱，培育箱，玻片及盖玻片，接种环，光学显微镜, 培育皿，牙签，离心管，枪头，移液枪，锥形瓶，试管铁勺，小塑料袋，试管，三角瓶，德 汉氏小管，磁力搅拌器，紫外灯牛肉膏，蛋白陈，NaCI,葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，可溶性淀粉，琼脂，玉米粉, 玉米浆，酵母粉，大豆粉，CaCI2, Na2HP04, (NH4)2S04,蒸储水，甘油，结晶紫,碘液， 95%的乙醇，番红溶液，甲基红，漠甲酚紫，H2O2,胰月心 多价豚，硫酸铁镂，硫代硫酸钠, pH缓冲液。