2022年分子生物学与基因工程 .pdf

《2022年分子生物学与基因工程 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年分子生物学与基因工程 .pdf（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、绪论分子生物学广义：研究蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。狭义：研究生物体主要遗传物质基因或DNA的结构及其复制、 转录、表达和调节控制等过程的科学。基因工程：是指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望 , 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体的细胞内 , 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。里程碑事件： 1944 年，Avery 在肺炎双球菌转化实验中证实了DNA是遗传的物质基础，标志着分子生物学的诞生。1953 年， Watson 和 Crick提出 DNA

2、双螺旋模型，为分子生物学的发展奠定了坚实的基础。1961 年，法国科学家Jacob 和 Monod提出了乳糖操纵子模型。1972 年， Berg 构建了世界上第一个重组DNA分子，开辟了生物学新领域遗传工程。1983 年， Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR ）技术，极大地推动了分子生物学的发展。90 年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”。目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。第二讲核酸的化学成分： 核酸是一种高分子的化合物，它的构成单元是核苷酸，是核苷酸的多聚体。核苷酸分子由三个部分组成：碱基：嘧啶、嘌呤五碳糖：核糖或脱

3、氧核糖磷酸脱氧核糖核酸（DNA ）和核糖核酸（RNA ）（1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖；（2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A） 、胞嘧啶（ C ） 、鸟嘌呤（ G）和胸腺嘧啶（T） ，RNA含有的碱基前3 个与 DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA通常是双链，而RNA 主要为单链；（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。核酸的分布： 真核生物的绝大部分DNA存在于细胞核内的染色体上，它是构成染色体的主要成分之一，还有少量的DNA 存在于细胞质中的叶绿体、线粒体等细胞器内。 RNA 在细胞核和细胞质中都有，核内则更多地集中在核仁上，少

4、量在染色体上。细菌也含有DNA 和 RNA ；多数噬菌体只有DNA ；多数植物病毒只有RNA ；动物病毒有些含有RNA ，有些含有DNA 。间接证据：（ 1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA在代谢上较稳定。（3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA 。（5）在各类生物中

5、能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。直接证据： 肺炎链球菌试验；噬菌体侵染实验；烟草花叶病毒侵染烟草实验（RNA ）DNA结构： 多核苷酸链片段（一级） ；双螺旋结构（二级）（1）两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上；核苷核苷酸名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 10 页 - - - - - - - - - （2）两条多核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为5 3方向，而另一条为3一 5方向，二者刚好相反；

6、（3）每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键与它互补的碱基相联系。互补碱基对A与 T 之间形成两对氢键，而 C与 G之间形成三对氢键。上下碱基对之间的距离为0.34nm；（4）每个螺旋为3.4nm 长，刚好含有10 个碱基对，其直径约为2nm ；（5）在双螺旋分子的表面大沟和小沟交替出现。维持双螺旋结构稳定性的力：（1）氢键（ 2）疏水作用碱基堆集力（3）范德华力（ 4）磷酸基的负电荷静电斥力（5）碱基分子内能Tm ：是指吸收值增加的中点。影响因素：1）DNA序列中 G + C 的含量或比例，含量越高，Tm值也越大（决定性因素）； 2 ）溶液的离子强度；

7、3 ）核酸分子的长度有关：核酸分子越长， Tm值越大； 4 ）某些化学物质； 5 ）溶液 pH值Z-DNA是左手螺旋，每个螺旋含12 个碱基对，比A-DNA拧得更紧 ; 双螺旋中不存在深沟，只有浅沟DNA的精细结构（1）依赖于序列的B-DNA构象变化：双螺旋的许多结构参数是随碱基序列的不同而在一定范围内变化的， 这称为 DNA的局部构象。 在 DNA中，随碱基序列的不同而变化的参数有许多，其中重要的有 螺旋扭转角、螺旋桨扭角、碱基对转动角 等，此外碱基对间还会发生滑动。以上这些变化使DNA形成了精细结构。 而精细结构正是DNA发挥功能时， 相应蛋白质因子与靶位点作专一性识别和结合的标志。（2）

8、连续 AT序列的构象；（3）含错配碱基对的B-DNA ；（4）DNA的局部构象与DNA结合蛋白：各种酶（如DNA聚合酶、 RNA聚合酶等）；调节蛋白（如 CAP ，Cro 阻遏物等）；这些蛋白质与DNA的结合涉及到生物学中的一些基本问题，如遗传和个体发育等，因此，核酸- 蛋白质交互作用已成为分子生物学中的一个研究热点。DNA的超螺旋结构（此处含有一道大题，详见平时的作业本）DNA结构的变化可以用数学式来表述： L = T W L 称为 DNA的连接数； T 称为盘绕数； W为超盘绕数。天然的 DNA都呈负超螺旋，但在体外可得正超螺旋环形 DNA分子会由超螺旋化而变得更为致密，它们在 超离心 中

9、的沉降速度和在凝胶电泳 中的迁移速度都增加，故超螺旋DNA可通过这两种方法来检测和分离。拓扑异构酶 含义：指细胞内存在着一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶DNA中的不寻常结构：交替的嘧啶、嘌呤重复序列倾向形成Z-DNA ；反向重复序列倾向形成十字形结构；构成镜像重复 的同型嘧啶 -同型嘌呤序列可能形成三链结构（ T-A-T; C-G-C ） ；富含 G的序列可能形成四链结构（端粒酶）G-G G-G k 对 DNA具有特征性，它与DNA的碱基对数目成反相关，因此，Cot 曲线 提供了一种测定DNA分子量的方法。 Cot 曲线也揭示单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分。Southern 杂交

10、鉴别DNA 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 10 页 - - - - - - - - - 第三讲染色体的结构特征: 染色体是由染色质构成的，染色质是由DNA 、 RNA和蛋白质形成的复合体。组蛋白在进化中是保守的；组蛋白在翻译后是受到修饰的，其中包括特异精、组、赖、丝和苏氨酸残基的甲基化、乙酰基化和磷酸化。染色质基本单位核小体。核小体由约200 bp 的 DNA和 H2A ，H2B H3及 H4各 2 分子所组成。念珠状。C值的含义： 在真核生物中，每种生

11、物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为C值，它是每种生物的一个特性，不同物种的 C 值差别很大。C值悖理： 一般认为，一个生物的形态学复杂性应该与其C值的大小大致相关，但是，C值和进化之间的复杂性并没有严格的相应关系。DNA的形状与大小：DNA一般为长而无分支的双股线性分子，但有些为环型，也有少数为单股环型。不同的DNA大小相差悬殊。虽然一般而言，复杂的有机体需要更多的DNA ，但不存在严格的对应关系。DNA的序列组织： 真核生物 DNA碱基组成上的异质性主要由于存在着以下3 类 DNA序列： 高度重复序列 （卫星 DNA ；微卫星 DNA ：Alu 家族）； 中度重复序列 （中度重复序

12、列包括rRNA和组蛋白基因， 每一基因组约含 1000 拷贝） ；单一序列 （包括酶在内的各种蛋白质基因）。简述真核生物基因组特点（此处含有一个问答大题，详见平时的作业本）第四讲丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R天冬酰氨Asn N天冬氨酸Asp D半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q谷氨酸Glu E甘氨酸Gly G 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W酪氨酸Tyr Y缬氨酸Val V 蛋白质概述： 蛋白质是由20 种左右的 - 氨基酸通过肽键相互连接

13、而成的一类具有特定的空间构象和生物学功能的高分子有机化合物。 螺旋和双螺旋的异同点（此处含有一个简答题，详见平时作业）蛋白质功能与结构的关系：蛋白质一级结构是空间结构的基础；一级结构相似的蛋白质，其基本构象及功能也相似；在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 10 页 - - - - - - - - - 关键部位的残基， 即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响“分子病”的镰

14、刀状红细胞性贫血仅仅是574 个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即亚基N 端的第6 号氨基酸残基发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传信息的突变；蛋白质的空间构象是其功能活性的基础。（此处含有一个简答题，详见平时作业）蛋白质的别构效应：在生物体内， 当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化。第五、六讲DNA 、RNA 合成：（分析题 ）SSBP ：单链结合蛋白半保留复制：DNA 在复制时首先两条链之间的氢键断裂使两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA 链， 这样新合成的子代DNA 分子中一条链来自亲代DNA ，另

15、一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。（名词解释 ）半不连续复制：DNA 复制时，两条链分别作模板，有一条链是连续合成的，这条链称为前导链；而另一条链合成时，只能以 5 3先合成冈崎片段，然后利用DNA 连接酶将各个片段连接起来形成随从链。（名词解释 ）不对称转录： RNA 的转录合成是以DNA 的一条链为模板而进行的，这种转录方式又叫做不对称转录（ 名词解释 ）解释复制方向5 3：RNA 聚合酶在DNA 复制起始处做为引物，它们的3OH 末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA 分子第一个磷酸二酯键的位置。DNA聚合酶催化dNTP 加到引物的3OH 末端，因而DNA 合成的方向是53 （

16、简答题 ）DNA 复制过程中的酶：拓扑异构酶IDNA 解链酶引物酶DNA 聚合酶 IDNA 聚合酶 III / DNA 连接酶拓扑异构酶II （ 填空题 ）DNA 复制时，先由拓扑异构酶作用于DNA 双螺旋分子，使之松弛，然后由DNA 解链酶作用，解开双链，此时在引发酶的作用下合成一段RNA 作为引物，在DNA pol III 的聚合作用下连续地合成前导链；随从链的合成依靠多种酶与蛋白质因子的参与：首先在引发酶的作用下合成RNA 引物，然后在DNA pol III的聚合作用下合成DNA 片段，它们共同形成冈崎片段。 RNA 引物是靠DNA 聚合酶 I 进行切割的，并由DNA 聚合酶 I 填补

17、RNA 引物切除后留下的空隙，最后由DNA 连接酶形成一条完整的链。DNA 复制的准确性很高，在原核生物中主要依靠DNA 聚合酶 I 的外切活性来校正复制过程中的碱基错配，而真核生物则依靠DNA 聚合酶来完成。在真核生物中，DNA 复制一般有多个起始点，主要依靠DNA 聚合酶 和来完成，另外还需要PCNA 等多种蛋白质因子参与。DDRP ：转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖 DNA 的 RNA 聚合酶。DDRP ：依赖 DNA 的 DNA 聚合酶 。第七讲参与蛋白质生物合成的物质基础：（1）合成原料。自然界由mRNA编码的氨基酸共有20种，只有这些氨基酸能够作为蛋白质生物合成的

18、直接原料。（2）mRNA 是合成蛋白质的直接模板。 mRNA 以它分子中的核苷酸排列顺序携带从DNA 传递来的遗传信息，作为蛋白质生物合成的直接模板，决定蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。（3）tRNA是氨基酸的运载工具。 tRNA 是一类小分子RNA ，长度为 73-94 个核苷酸， tRNA 分子中富含 稀有碱基和修饰碱基 ，tRNA 分子 3端均为 CCA 序列 ，氨基酸分子通过共价键与A 结合，此处的名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 10 页 - - -

19、 - - - - - - 结构也叫 氨基酸臂 。tRNA分子中还有一个反密码环（4）核糖体蛋白质的合成场所（5）蛋白质生物合成的必需因子。起始因子（IF） 。延长因子（EF） 。释放因子（ RF ） 。1968 霍利柯拉那尼伦伯格遗传密码的特点： （1）起始码（ 2）终止码（3）密码无标点符号（4）密码的兼并性。一种氨基酸有几组密码子，或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的兼并性，这种简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸，这对于保证物种的稳定性有一定意义。如：GCU ， GCC ，

20、GCA ，GCG 都代表丙氨酸。（5）密码的通用性核糖体作为合成场所的原因：（解释，分析，简答）任何生物的核糖体都是由大、小两个亚基组成。（1）mRNA结合位点：由几种蛋白质构成一个结构域，负责与mRNA 的结合。（2） P 位点：又叫做肽酰基tRNA 位或给位。它是结合起始 tRNA 并向 A 位给出氨基酸的位置。 （3）A 位点：叫做氨基酰tRNA 位或受位。是结合一个新进入的氨基酰tRNA 的位置。 （4）转肽酶活性部位： 位于 P 位和 A 位的连接处。（5）结合参与蛋白质合成的起始因子（IF） 、延长因子 (EF)和终止因子或释放因子(RF) 。蛋白质生物合成的基本过程：（含一道大题

21、，详见平时作业本）蛋白质翻译后加工修饰：（ 1）氨基端和羧基端的修饰。氨基端乙酰化；甲酰基经酶水解而除去， 蛋氨酸残基由氨肽酶催化而水解除去，包括除去信号肽序列，因此，成熟的蛋白质分子 N-端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。（2）共价修饰。 羟基化，糖基化，磷酸化，二硫键的形成 （3）亚基的聚合。有许多蛋白质是由二个以上亚基构成的，这就需这些多肽链通过非共价键聚合成多聚体才能表现生物活性（成人血红蛋白由两条链，两条链及四分子血红素所组成）。 （4）水解断链。一般真核细胞中一个基因对应一个mRNA ，一个 mRNA 对应一条多肽链， 但也有少数的情况，即一种翻译后的多肽链经水解后产生几种不同的蛋白质或

22、多肽（哺乳动物的鸦片样促黑皮激素）。第八讲基因表达指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。简述大肠杆菌乳糖操纵子的结构、各部分的功能及基因表达调控机理（此处含有一道大题，详见平时作业本）基因表达组成性表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。其中某些基因表达产物是细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因可称为看家基因，这些基因中不少是在生物个体其它组织细胞、甚至在同一物种的细胞中都是持续表达的，可以看成是细胞基本的基因表达。组成性基因表达也不是一成不变的，其表达强弱也是受一定机制调控的。基因表达适应性表达：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达

23、。应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导，这类基因被称为可诱导的基因；相反， 随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏，相应的基因被称为可阻遏的基因。BAC ：细菌人工染色体载体（名词解释 ）YAC ：是酵母人工染色体，是目前能容纳最大外源DNA 片段的载体（名词解释 ）MAC ：乳类人工染色体载体（名词解释 ）结构基因群：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(SG )，各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。启动子： 指能被 RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA 序列。（填空题 ）操纵子： 指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA 序列。终止子： 指给予

24、 RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 10 页 - - - - - - - - - 增强子： 一种能够提高转录效率的顺式调控元件。调控基因： 它是指编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白 称为 阻遏蛋白 ， 其介导的调控方式称为 负性调控 。与操纵子结合后能增强或起动调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白 ，所介导的调控方式称为正性调控 。调控基因可以在结构基因群附近、也可

25、以远离结构基因，它是通过其基因产物调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA 链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA 链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用 ，调控基因就属于 反式作用元件 ，其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子。启动子、 操纵子位于紧邻结构基因群的上游，终止子在结构基因群之后，它们都在结构基因的附近，只能对同一条DNA 链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用 ，启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件。操纵元的基本组成：1）结构基因群；2）启动子； 3）操纵子； 4）调控基因； 5）终止子基因表达的组织特异性；阶段特异

26、性。一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信息，在个体发育分化的各个阶段，显示出 基因表达调控在空间和时间上极高的有序性，从而逐步生成形态与功能各不相同、极为协调、巧妙有序的组织脏器。第九讲基因工程工具酶的概念：在 DNA 分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA 进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶。工具酶分类： 1）核酸水解酶类（核酸内切酶、核酸外切酶）；2）核酸合成酶类（DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 DNA 连接酶）；3）核酸修饰酶类（甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸转移酶、磷酸酶）限制性内切酶定义： 指能识别双链DNA 分子内部特

27、异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶。分类： 即 I 型、 II 型、 III 型酶三类。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 10 页 - - - - - - - - - 特性： 分子质量为60kd ，单链多肽，最适pH 为 68。NaCl 有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用。对热不稳定，通常贮存于20环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50 甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。1）每一种酶

28、都有各自特异识别位点；2）大多数限制酶是错位切割双链DNA ，产生 5或 3粘性末端；3）部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA 双链，产生平末端根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名：1、用来源细菌的英文缩写斜体符号命名2、它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1 个字母3、第二、三字母小写，来源细菌种名的头2 个字母4、第四个字母代表菌株5、最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。回文结构： 限制性核酸内切酶识别序列具有180 旋转对称的回文结构。5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 影响因素： 温度：一般37 盐离子浓度： Na， Mg2 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的

29、Tris-HCl 缓冲体系， DTT 用于保持酶稳定性和活性 反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加50甘油作为保护剂，一般在-20 保存。 反应时间：通常为1h；进行大量DNA 酶切反应时一般让酶解过夜 DNA 纯度和结构：一个酶单位定义：1h 内完全酶解1g噬菌体DNA 所需的酶量同尾酶： 某些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端。（名词解释 ）同位酶： 识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。（名词解释 ）同功异源酶（同裂酶） ：来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶。（名词解释 ）酶的活性单位1 个活性单位：在适当的反应条件下(包括温度、 pH 和离

30、子强度等 ),1h 内在50l 容积中完全酶解1g 特定 DNA 底物 (通常用入DNA) 所需要的酶量。 （名词解释 ）DNA 连接酶作用机理：连接酶的作用：在双链DNA 中，DNA 连接酶能催化具有邻近3羟基和5磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体 DNA 片段连接，使之成为一个完整的重组DNA 分子。连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。结果：黏性末端（包括平末端）连接起来。作用过程1） 连接酶与辅助因子ATP 或 NAD 形成酶 -AMP 复合物；2） AMP 作用于 DNA缺口的 5-末端磷酸基团；3）缺口 3 -OH 对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷

31、酸二酯键，封闭切口Taq DNA 聚合酶： 从栖热水生菌中分离纯化的依赖DNA 的 DNA 聚合酶，最适温度75-80；最适 pH7.8(Tris-HCl)；需要 Mg2+(10 mmolL)，在低浓度 Mn2+(2 mmol/L)中有低活性， Ca2+ 使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI L 对活性无影响，而最适浓度NaCl为 40 mmol/L ，KCl 为 60 mmol/L 。第十讲概念： 携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体。即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA 分子。必备条件： 具复制原点： 在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能与携带的

32、外源DNA一起复制能与目的基因连接- 具多个限制酶切点便于筛选鉴定-具有标记基因，而宿主细胞并不具有操作简单分子量小、高拷贝数、转化效率高、容易从宿主细胞中分离纯化克隆载体： 可以克隆和运载目的基因并转移到宿主细胞中进行复制和扩增。细菌质粒载体 、噬菌体载体 、柯斯质粒载体。概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、 易分离和导入的环名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 10 页 - - - - - - - - - 状双链 DNA 分子1

33、0kb。分类： F 质粒（ F 因子或性质粒）R 质粒（抗药性因子）Col 质粒（大肠杆菌素因子）pBR322是以 4 个不同质粒DNA 为基础通过DNA重组技术发展构建而成的克隆载体。pBR322 载体的特点：分子量小（4.3kb ） 、拷贝数高、含四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性内切核酸酶仅有一个切割位点。pUC 载体 系统以 pBR322为基础，去除了包括四环素抗性基因在内40的 DNA ，换用了M13 噬菌体的476bp 片段，内含LacZ 基因的 5-序列以表达半乳糖苷酶的片段，LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac 和操纵基因O 命名规则

34、：pUC19 “p”表示质粒（ plasmid ）“UC ”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称“19”表示该质粒的实验编号蓝白斑： 如果在多克隆位点中插入外源DNA ，打断了 -半乳糖苷酶的部分基因，不再产生-肽链，就不能和宿主细胞产生的多肽片段结合生成有活性的-半乳糖苷酶，结果X-gal保持无色，插入外源DNA 菌落呈白色。 检测结果 ：重组子菌落是白（无）色的，而空载体转化的菌落是蓝色的。噬菌体即细菌病毒一类的总称。25kb柯斯质粒载体又叫粘粒载体， 这是一种由人工构建的含有噬菌体DNA 的 cos 位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征，被称为cosmi

35、d ，指带有粘性末端位点的质粒40kb 。构建基因文库表达载体： 克隆、运载和转移目的基因到受体细胞中进行复制和扩增,使之表达。表达载体的特点： 具有克隆载体所具有的基本特性；具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件：启动子、核糖体结合位点（RBS ） （RBS 由 SD 序列、核糖体小亚基识别序列和起始密码（ ATG）组成，但有时也将SD 序列称为核糖体结合位点。SD：Shine-Dalgarno，人名） 、终止子（依赖因子的转录终止；不依赖因子的转录终止）第十一、第十二讲PCR （聚合酶链式反应）定义：在试管中，利用DNA 聚合酶、一对引物和四种dNTP ，对模板 DNA 反复多次地进行复制

36、，从而得到大量扩增特定产物的反应过程。PCR 体系： 待扩增的DNA （模板），一对寡聚核苷酸引物，耐高温的Taq DNA 聚合酶， 4种脱氧核苷酸的混合物（dNTP ） ， Mg2+/Thris-HCl PCR 反应程序： 变性 94 退火 55 延伸 72预变性 4min 变性退火3060 秒延伸再延伸7min 反转录 PCR（RT-PCR ）: 反转录 PCR 即以 mRNA 作为模板，进行反转录合成cDNA （单链 DNA ）的 PCR 方法.。 一般分两步进行：第一步用反转录酶将RNA 反转录成cDNA ，第二步以cDNA 为模板进行PCR 扩增。目前已发现一种rTth 酶，既有反转

37、录酶活性又有DNA 聚合酶活性。因此做RT-PCR 可简单到用一种酶和一种缓冲体系在一个反应管内直接扩增RNA 。生物芯片： 是将细胞、蛋白质、DNA 及其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术集中名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 10 页 - - - - - - - - - 点在一个平方厘米大小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、高效、 敏感的大信息量的检测、分析和处理。特点： 高通量、微型化、自动化生物芯片主要分为基因芯片 和蛋白芯片DNA测序技术

38、： ddNTP ，双脱氧核苷酸终止法：原理：利用DNA聚合酶合成DNA ，在DNA 的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序。反应的终止依赖于底物2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP ） 。在 DNA 聚合酶作用下能通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，形成磷酸二酯键，但由于缺乏3羟基而不能同后续的dNTP 或 ddNTP 形成磷酸二酯键，因此，一旦 ddNTP 掺入 DNA 的新生链中，聚合反应就会终止。化学修饰法： 用 4 组化学试剂裂解末端标记的DNA 分子，其中每一组化学试剂特异地针对一种或一类碱基进行切割，由此产生的4 组裂解产物均为不同长度的DNA 片段的混合物

39、。每一组反应产物中都有一套带相同标记末端的长短不一的DNA 片段原理： 1）放射性同位素标记待测DNA3 末端或 5末端 ; 2）用特殊的化学试剂处理来裂解具末端放射标记的DNA 分子 ,造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA 片段3）然后用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA 序列转 硝酸纤维膜上Northern杂交Southern杂交靶核酸RNA DNA 电泳变性电泳非变性电泳转膜毛细管虹吸法转移前无须中和毛细管虹吸法转移前须中和基因文库 : 来自某一生物基因组DNA （或来自某一组织所有不同的mRNA 的每一种cDNA分子）经酶切所形成的全部DNA 片段克隆

40、在细菌中增殖后的集合体或应用DNA 重组技术构建的 含有基因组的全部基因的DNA 克隆群体。基因工程基本流程：1）分离目的基因DNA 2）选择载体DNA 3）重组 DNA 分子4）转化（ Ecoli 、植物、动物）5）筛选鉴定cDNA 文库构建：1） 分离细胞总RNA ，然后利用真核mRNA 分子的 3 端多聚 A 结构将 mRNA 从 tRNA和 rRNA 中分离出来2）以 mRNA 为模板逆转录合成cDNA 第一条链3）合成 cDNA 第二条链有两种方法:一是用大肠杆菌的RNaseH切割 RNA-DNA杂交分子产生 RNA 短片段，DNA 聚合酶 I 以 RNA 短片段为引物合成新的DNA

41、 链;二是利用 cDNA第一链的3端出现的发夹环结构，即第一链末端返折为合成cDNA 第二条链提供引物。（置换合成法、自身引导法）4）这些体外合成的cDNA 经两端补齐后而具平头末端，在 cDNA 分子的两端与带有限制性核酸内切酶位点的人工接头连接，然后酶切后与载体(通常是噬菌体)连接，导入大肠杆菌，即得cDNA 文库。mRNA cDNA 双链 cDNA 重组 DNA 分子c DNA 文库反转录酶复制载体受体菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 10 页 -

42、- - - - - - - - 第十三讲HGP （人类基因组计划）的主要内容：人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。绘制四张图谱（遗传图、物理图、序列图、转录图） 。遗传图（连锁图） ：指基因或 DNA 标记在染色体上的相对位置与遗传距离。cM （基因或 DAN 片段在染色体交换过程中分离的频率）物理图： 以已知核苷酸序列的DNA 片段为“路标” ，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。转录图 : 以 EST（expressed sequence tag，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。EST ：通过从cDNA 文库

43、中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA 的 5或3端序列称为表达序列标签（EST ） ，一般长 300-500bp左右序列图（分子水平的物理图）: 序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图。 1m 既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、 调节序列和功能未知序列的总和。事例： 90 年， 4 岁女童， SCID （中毒联合免疫缺陷症）首例基因治疗美国名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 10 页 - - - - - - - - -