2022年分子生物学实验理论考试 .pdf
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1、2012-2013 学年第二学期分子生物实验考试题库1、PCR 原理是什么?答:PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。 它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA 片段两侧互补的寡核苷酸。双链 DNA 是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA 分子(变性) ,两引物分别与两条DNA 的两侧序列特异复性, 在适宜条件下, DNA聚合酶以单链 DNA 为模板,利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸,在引物的引导下,按5 3 方向复制互补DNA ,即引物的延伸。在适宜的条件下,这种热变性 复性延伸的过程不断循环重复, 前一个循环的产物DNA 可作
2、为后一个循环的模板DNA 参与 DNA 合成,使产物 DNA 的量按 2n 方式扩增。2、PCR 一般体系应加入哪些试剂?答:10*PCR 缓冲液(含 Mg+) 、模板 DNA 、四种 dNTP、一对引物、耐热Taq聚合酶。3、PCR 防止其它 DNA 污染,应注意哪些问题?答:标本放置时密封要严避免溢于容器外,容器要清洁避免造成相互间交叉污染;移液器使用要规范避免污标本间污染;无菌工作台操作, 避免气体中有杂菌。4、影响 PCR 产物产量的因素主要有哪些?答:引物、酶的种类及浓度、dNTP 的质量(优劣)与浓度、模板核酸的量与纯化程度、 Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。5、引物设计应注意
3、哪些问题?答:引物长度不宜过长20bp 左右较佳;引物扩增片段的长度以200-500 为宜;引物碱基的中G+C 的含量应在 40-60%为宜,G+C 太少则扩增效果不佳,G+C 过多则易出现非特异条带;避免引物内部出现二级结构,避免两天引物间互补,特别是 3端的互补否则会形成二聚体结构;引物 3端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基, 应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤?答:克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技术对基因进行大量扩增,首先准备好实验材料大体为:需扩增的模板DNA 、DNA 聚合酶、 dNTP 混合液、 PCR缓冲液
4、、引物等、其过程大体分为3 个步骤:第一步:变形:通过加热使DNA模板双螺旋链解离为单链,第二步:退火:当温度突然降低时。由于模板DNA结构复杂难再互补, 而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA 互补杂交从而使引物结合到模板上DNA 上,第三部:延生:在DNA 聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下 DNA 连开始延伸。 以上 3 个步骤为一个循环,数小时后即可得到大量扩增的目的片段。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页,共 6 页 - - - - - - - - -
5、7、什么是质粒?质粒的基本性质有哪些?答:a质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA) 分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 b 具有复制起点。 携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切酶的切割位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。8、质粒抽提实验中溶液I、II 、III 各有什么作用?答:溶液 I:由葡萄糖 ,EDTA,Tris Cl 组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒 DNA;EDTA 的作用是络
6、和掉 Mg2+等二价金属离子 ,防止 DNA 酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适 PH 范围。 溶液 II: 由 SDS与 NaOH 组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH12)的作用是破坏氢键,使 DNA 分子变性。溶液 III: 由 KAc 与 HAc 组成,是 pH 值为 5.5 的高盐溶液 .能中和溶液 II 的碱性,使染色体 DNA 复性而发生缠绕并使质粒DNA 复性.K+离子会与 SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA 也会与蛋白质-SDS 形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子
7、的质粒DNA 分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。9、碱裂解法抽提质粒DNA 的基本原理是什么?答:碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。 PH 介于 12.012.5时,线性 DNA 变性,双链打开,而质粒 DNA虽变性,但两条互补链彼此缠绕,当PH 恢复到中性时,质粒DNA 可迅速准确的完成复性,而线性DNA 复性较困难,缠绕成网状,通过离心可沉淀除去。10、在碱裂解法提取质粒DNA 操作中应注意哪些问题?答: (1)正确使用移液器。(2)溶液 ll 必须新鲜配制。(3)加入酚 -氯仿后必须充分混匀。(4)混匀的过程不能太过剧烈。 (5)
8、每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。 (6)吸取酚 -氯仿溶液时要将Tip 头插入液体分层的下侧。 【可根据第一次试验自己写的注意事项进行补充】11、在碱裂解法提取质粒DNA 时, 酚/氯仿的作用是什么?答:酚是强烈的蛋白质变性剂,能有效使蛋白质变性而除去,氯仿有强烈的脂溶性,去除脂类杂质,本身酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 的主要作用是抽提蛋白质12、碱裂解法提取的质粒DNA 分子一般有几种构象?电泳时移动速率有何差异?答:超螺旋 DNA线性 DNA开环 DNA 13、提取植物基因组DNA 的基本原理是什么?在操作过程中应该注意什么?名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 -
9、 - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页,共 6 页 - - - - - - - - - 答:基本原理 :利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有的 SDS 溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA 抑制DNA 酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA 溶液经异丙醇沉淀。注意事项 :材料要新鲜娇嫩,叶片研磨地越细越好;操作应为无菌操作;操作应温和,不宜剧烈晃动; 注意移液器的正确使用。14、在植物基因组提取过程中,DNA 降解的可能原因?答:原因 :从植物中提取DN
10、A 时没对细胞内的DNA 酶进行灭活; 操作过程中被细菌污染了; 口水等含酶物质飞入样品中; 温度、PH 等变化过于剧烈。15、在植物基因组提取过程中,提高DNA 产量的措施?答:应当选取幼嫩的叶片,因为幼嫩叶片中的DNA 含量高些;组织抽提前要保存在液氮中,以免 DNA 被破坏;纯化时注意抑制核酸酶污染,使用EDTA 等防止 DNA 降解;整个实验过程应该温和操作,不能剧烈振荡,混合过程要轻缓,减少抽提,减少 DNA 片段被认为降解, 因为过度振荡会使DNA 断裂成小片段。16、在使用苯酚进行DNA 提取时应该注意什么?答:酚一定要进行碱平衡,苯酚具有高度腐蚀性,飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人
11、体造成损伤,应当注意防护;它是出去蛋白质的,要充分振荡使蛋白质变性,但不能太剧烈而打断DNA;离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚氯仿,尽量只取上清,不应该让苯酚最后仍有残留,需抽提干净。17、在提取植物基因组DNA 过程中,使用苯酚与氯仿的作用是什么?答:用苯酚和氯仿抽取,去除多余的蛋白,保证提取的基因组较纯净。18、在植物基因组提取过程中,该如何检测和保证基因组DNA 的质量?答:检测:琼脂糖凝胶电泳;保证DNA 活性:用 EDTA 抑制 DNA 酶活性,从而保证 DNA 不被破坏。19、什么是限制性内切酶?答:限制性内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割 D
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