鱼类生理学具体实验内容.doc

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1、鱼类生理学实验实验一 反射中枢活动的某些基本特征及反射弧的分析 实验项目学时：3* 实验要求： 必修 选修 一、实验目的及要求：通过对某些脊髓反射（如脊蛙的屈肌反射）的分析，了解反射弧完整性与反射活动的关系。掌握反射时的测定方法，通过用不同浓度的硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射。以脊蛙的屈肌反射为指标，观察反射中枢活动的某些基本特征，并分析它们产生的机制。二、实验基本原理：在中枢神经系统的参与下，机体对刺激所产生的具有适应意义的规性律性反应过程称为反射。将动物的高位中枢切除仅保留脊髓的动物成为脊髓动物（如脊蛙），它们产生的反射活动为单纯的脊髓反射，由于失去高位中枢的控制反射活动较为简单，便与观察与

2、分析反射过程的某些特征。反射活动的结构基础是反射弧。典型的反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出神经和效应器五个部分组成。反射弧必须保持完整性，才能引起反射，其中任何一个环节受到破坏，反射活动就无法实现。 在反射活动中，由于神经元特别是中间神经元联系方式的不同，使反射活动表现出种种特征。如：反射时（从刺激作用于感受器至效应器出现反应所经历的时间）的长短、反射活动空间范围的大小、反射活动持续时间的久暂以及引起反射活动的刺激条件等等。三、主要仪器设备及实验耗材：蟾蜍、硫酸溶液（0.1%,0.3%,0.5%,1%）、纱布。蛙类手术器械、铁架台、血管钳一把、秒表、玻璃平皿、肌夹、搪瓷杯、小滤纸（约1

3、cm1cm）、烧杯。四、实验内容或步骤：1、实验准备取蟾蜍一只，用粗剪刀由两侧口裂剪去上方头颅，制成脊蟾蜍。将动物俯卧位固定在蛙板上，于右侧大腿背侧纵行剪开皮肤，在股二头肌和半膜肌之间的沟内找到坐骨神经干，在神经干下穿一条细线备用。手术完后，用肌夹夹住动物下颌，悬挂在铁架台上。 2、实验项目 （l）反射中枢活动的某些基本特征反射时的测定：在平皿内盛适量0.1%硫酸溶液，将蟾蜍一侧后肢的一个脚趾尖浸入硫酸溶液中，同时按动秒表记录从浸入时起至后肢发生屈曲所需要的时间，并立即将该足趾浸入搪瓷杯水中浸洗数次，然后用纱布拭干。用上述方法重复三次，注意每次浸入趾尖的深度要一致。三次所测时间的平均值，即为此

4、反射的反射时（两次实验间隔至少23min）。然后平皿中分别换以0.3%、0.5%、1%的硫酸溶液再重复上述测定，比较四种浓度硫酸所测之反射时是否相同。 （2）反射弧的分析 用浸有1%硫酸溶液的小滤纸片贴在下腹部。观察双后肢有何反应？待反应出现后，将动物浸于搪瓷杯的清水内洗掉滤纸片和硫酸，用纱布擦干皮肤。提起穿在右侧坐骨神经下的细线，剪断坐骨神经，再重复上述实验，比较两次结果有何不同？ 分别将左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸的小平皿内（两侧浸没的范围相等且仅限于趾尖），双侧后肢是否都发生反应？ 沿左后肢趾关节上做一环形皮肤切口，将切口以下的皮肤全部剥脱（趾尖皮肤一定要剥干净），再用1%硫酸溶液浸泡该

5、趾尖（切不可将其他趾尖浸入），观察该侧后肢的反应。将一1%硫酸纸片贴于左后肢皮肤，观察引起的反应，用搪瓷杯中清水洗掉纸片及硫酸，擦干皮肤后，将探针插入脊髓腔内反复捣毁脊髓，再重复刚才的实验。结果如何？方法评估操作简单、易于掌握，为常规实验方法。应用意义为了解中枢神经系统某些特征及活动规律的验证性实验，主要用于观察分析中枢神经系统内反射中枢的活动规律及反射弧的完整与反射活动的关系。注意事项 1、离断颅脑部位要适当，太高可能保留部分脑组织而出现自主活动，太低也会影响反射的引出。 2、每次用硫酸溶液或纸片处理后，应迅速用搪瓷杯中的清水洗去皮肤上残存的硫酸，并用纱布擦干，以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液。

6、测定反射时的硫酸浓度应由低到高。 3、浸入硫酸溶液的趾尖应仅限于一个，而且每次浸泡的范围也应恒定，切勿浸入太多。五、思考题1、何谓反射时，反射时与刺激强度之间有何关系？2、反射弧包括哪几部分？剥去趾关节以下的皮肤后不再出现原有的反射活动，为什么？实验二 鱼类血液红细胞和白细胞的计数实验项目学时：3* 实验要求： 必修 选修 附件一 鱼类红细胞与白细胞的计数（必修）目的与原理掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血

7、滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。实验对象鲤、鲫或草鱼。试剂与器材显微镜，血细胞计数板，计数器，鱼用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管及试管架，移液管（1ml及2ml），红、白细胞稀释液（或0.850.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。实验步骤1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图1-5-1）

8、。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.850.9%的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另

9、一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。方法是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上，或用纱布包好握在手里，用浸润过抗凝剂的注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入，依据解剖部位确认已刺入心脏，可稍后拔针管，如有血液吸入即可，否则重新拔出再刺。 图 1-5-1 血细胞计数室结构 图 1-5-2 血细胞计数区尾动脉取血方法 是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10l血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20l

10、血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗23次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置23分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中

11、央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依照“数上不数下， 数左不数右”的原则进行计数（图1-5-3）。 计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。5计算 红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000即得每立方mm血液中红细胞总数。图1-5-3 血细胞计数方式（实心圈表示计数的红细胞，空心圈表示不应计数的红细胞）计算公式为：红细胞数/mm3 = 5个中格红细胞数稀释倍数/计数的

12、5个中格容积（1） 稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10L（0.01ml），为200倍。（2） 计数室5 个中格容积为0.20.20.15 = 0.02 mm3。白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。计算公式为：白细胞数/ mm3 = 4个大方格白细胞数稀释倍数/ 计数的4 个大格容积（1） 稀释倍数等于稀释液0.38ml+血20L（0.02ml）/0.02ml，为20倍。（2） 计数室4个大方格容积为110.14= 0.4 mm3。方法评估采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定的最常用的基本方法，目前虽有各种自动化分析方法，但该方法由于经典、

13、方便、实用，仍较广泛用于血液检验和科研实践中。 应用意义红细胞是血液中数量最多的有形成分，在正常情况下几乎占血容量的12，故使血液呈红色粘稠混悬液。红细胞数量正常情况下保持相对稳定的。多数鱼100300万个/mm ，高者可达400万个/mm3 低者数十万/ mm3。 鱼类红细胞数也因性别不同而有差异，一般雄鱼的红细胞数比雌鱼多。此外鱼类红细胞数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等）而出现一定的差异。环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多。鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而变化，此外，鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有

14、关：饱食消化力旺盛时多，长期饥饿白细胞（特别是嗜酸性白细胞）显著减少。注意事项1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次） 95%酒精（两次） 乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。思考题1、综合实验所得结果，与红、白细胞的正常值相对照，有何变异？为什么？2、为什么机体正常血细胞数可维持在相对稳定的数量水平？3、试讨论鱼类红细胞的正常值及其应用意义？4、白细胞数量的变化有何生理意义？5、血细胞计数室中央的大方各中每一种方格的容积是多少？附

15、血细胞稀释液1、白细胞稀释液冰醋酸（破坏红细胞） 1.5毫升1%龙胆紫（染白细胞核便于计数） 1毫升蒸馏水 加至100毫升2、红细胞稀释液NaCl (维持渗透压) 0.5克 Na2SO4 (使溶液比重增加，红细胞分布不易下沉) 2.5克 HgCl （固定红细胞形状） 0.25克 蒸馏水 加至100毫升 附件二 鱼类血涂片的制作和白细胞分类计数（必修）目的与原理 了解各种类型白细胞的形态特征，掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法，进行不同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜

16、色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内

17、的致病物，各种细菌和病毒。淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wrights）染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法。实验对象 鱼（淡水鱼和海水鱼均可）。试剂与器材 试剂：染色液的配制：1、姬姆萨（Giemsa）染液的配制（1）原液配制：Giemsa 粉剂（0.8 g）；甘油（医用）50 ml；甲醇50 ml。将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均匀，置于3740温箱内812h，过滤，装入棕色试剂瓶内，密封保存备用。（2）稀释液临用时取Giemsa原液5ml，加磷酸盐缓冲液（pH6.46.

18、8）50 ml，即为Giemsa稀释液。（3）pH6.46.8磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g，加少量蒸馏水溶解，调整pH至6.46.8，加水至1000ml。2、 瑞氏（Wrights）染液的配制（1）原液配制：瑞氏染料粉剂0.1g；纯甲醇60 ml。(2) 配制步骤： 将瑞氏染料粉放人乳钵内，加少量甲醇研磨。 将已溶解的染料倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇进行研磨，如此反复操作，直至全部染料溶解为止。 装入玻璃瓶内密封，在室温下保存一周即可使用。 新鲜配制的染料偏碱性，放置后呈酸性，染液储存时间越久，染色愈好。器材：显微镜，香柏油，载玻

19、片，盖玻片，玻片水平支架，采血针或注射器，计数器，小滴管，蜡笔，消毒棉球，瑞氏染液，pH6.46.8磷酸盐缓冲液，姬姆萨染液，蒸馏水。实验步骤1、血涂片的制作：取一滴血（采血方法见实验49），滴于洁净无油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方，然后向后拉，当与血滴接触后，血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈3045度的角度平稳地向前推至玻片另一端（图1-5-4）。推时角度要一致，用力应均匀，即推出均匀的血膜（血膜不可过厚、过薄）。将制好的血涂片晾干，不可加热。2、血涂片的染色步骤：（1）用蜡笔在血膜两端各划一道线，以免染料外溢，置涂片于水平的支

20、架上。（2）用小滴管将瑞氏染液滴于涂片上，并盖满划出的涂片部分固定约半分钟。（3）用小滴管再加1.5倍缓冲液或姬姆萨（Glemsa）染液，轻轻摇动，并轻吹液体使染色液与缓冲液混合均匀，静置510分钟。（4）用蒸馏水冲洗（如自来水的pH值稳定于7.2左右时亦可代用）。冲洗血膜时应将玻璃片持平，冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。3、白细胞分类计数：先用低倍镜检查涂片及染色是否均匀。然后加一滴香柏油于血膜厚薄均匀处（一般在体尾交界处），在油镜下由此处开始按其形态特征进行分类计数，计数移动时避免重复。根据所见到的100个白细胞，记录各种白细胞所占的百分数。例如：嗜中性

21、白细胞分数（%）=计数嗜中性白细胞个数/计数总白细胞个数100%。图1-5-4 血涂片制备示意图红细胞呈桔红色；中性粒细胞核为蓝紫色，颗粒呈蓝紫至紫红色；嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红至桔红色；嗜碱性粒细胞颗粒呈深蓝紫色；淋巴细胞核呈深蓝紫色，胞质呈天蓝色；单核细胞核呈浅紫色，胞质呈灰蓝色。方法评估显微镜法白细胞分类是经典、传统的血细胞分类法，目前还无任何仪器可以完全取代。它能够准确地根据细胞形态特征进行分类计数，并可及时发现异常细胞。血液分析仪进行细胞分类主要是从细胞的体积大小、细胞核形、细胞化学染色等方面进行检测，检测速度快，分析细胞多，适宜于大批量标本的分析。对其检测出来的异常标本，要准确识别细

22、胞类别及确认病理改变还必须以显微镜检查为准。应用意义在不同的生理状态下，不同种类白细胞数目波动较大。如运动、寒冷、消化期、繁殖期等，此外，在机体失血、剧痛、急性炎症、慢性炎症等病理状态下，白细胞也增多。例如，急性感染、急性中毒、严重组织损伤、恶性肿瘤等中性粒细胞增多；某些病毒、细菌感染、某些慢性感染时，淋巴细胞数量增多。注意事项1、所用玻片必须干净，无油污。2、如染色太浅，可按照原来步骤重染；染色太深或有沉淀物则可用甲醇脱色后重染。3、如白细胞核为天蓝色则染色时间过短。如红细胞呈紫红色，表示染色时间过长。4、染色时切勿使染液干涸，否则发生不易去掉的沉淀。5、冲洗时不可先倾倒染色，应先轻轻摇动玻

23、片，缓慢加水使沉渣泛起，然后再用水冲洗。6、水冲洗时间不宜过长，否则会脱色。思考题1、试述瑞氏（Wrights）染色法区分各种白细胞的依据？2、怎样才能制备一个形态清晰的血涂片？3、实验所得结果与正常值相对照，有何变异？为什么？实验三 温度对鱼类呼吸代谢的影响实验项目学时：4* 实验要求： 必修 选修 一、实验目的及要求：掌握测定鱼类等水产动物耗氧率的方法，并用此法测定水产动物的耗氧率，分析和计算被测动物的代谢率（或代谢强度）。掌握影响鱼类呼吸代谢的主要影响因素。二、实验基本原理：耗氧率经常被直接用来表示机体的代谢强度，因为机体的代谢率与它们的耗氧率呈正相关性，这是一种简便的测算方法，对于养殖

24、工作者来说是非常适用的。除此以外，耗氧率也是间接测定能量代谢的重要指标之一。温度和pH是影响耗氧率的重要因素。本实验通过测定温度和pH对鱼类耗氧量的影响，从而可以了解温度和pH对鱼体代谢活动的影响。测定水生生物耗氧率的仪器装置及测定方法有多种。常用的有两类：一是静水式，二是流水式。本实验采用的是静水密闭测定法。三、主要仪器设备及实验耗材：试剂：1、硫酸锰：称取52gMnSO45H2O（或37gMnSO4H2O），用90毫升蒸馏水溶解，然后稀释到100ml。静置数日，取清液使用。2、碱性碘化钾：50gNaOH(或70克KOH)及15g固体KI，分别溶于50及35ml纯水中。然后将两液混合，冷却后

25、稀释到100ml。放入到聚乙烯瓶中盖严保存，不可用磨口试剂瓶保存。3、浓H2SO4：市售比重1.84的试剂。4、HCl（1：1）5、0.05N Na2S2O3：称取2.5gNa2S2O35H2O ,用煮沸后冷却的蒸馏水配制成500ml，加入NaOH 0.2g使溶液呈碱性，减慢Na2S2O3分解，贮存于棕色瓶中，浓度要标定。6、0.5淀粉：称取1g可溶性淀粉于300ml烧杯中，用少量纯水调成悬浊液。冲入刚煮沸的200ml纯水，并再煮沸即可。材料：鲫、罗非鱼或其它水生动物。器材：水产动物呼吸实验装置；酸式滴定管；恒温水浴锅；采样瓶（或磨口试剂瓶）30ml若干；三角锥瓶100ml若干；微量滴定管；乳

26、胶管；滴定架；蝴蝶夹；罗纹水止；移液管；吸耳球等。四、实验内容或步骤：1、实验设置不同的试验温度，如金鱼（鲫鱼），可设置10、20和30三个试验温度。每个试验温度需要有一个水浴，将温度预先调节好，如需要的温度低于室温，需要加冰降温，高于室温则需要加热，并使水温保持相对稳定。2、实验设置不同的pH值，然后测定不同pH下的耗氧量并作分析对比。3、安装呼吸室（见图1或2）：呼吸室为一个巨塞大口玻璃瓶，容积根据动物个体大小而定。要求是水生动物在呼吸室内活动自如，在实验时间内动物保持充足的氧供应。呼吸室入口装二只玻璃管，分别为入水管和出水管，另外呼吸室上面有温度计可测量呼吸室内的水温。安装时，首先将呼吸

27、室充满水，放入实验动物（实验动物放入前需称量），使测试动物稳定半小时方可开始实验。4、测定实验开始时水中溶解氧（初溶氧），及实验结束时水中溶解氧（末溶氧）。5、溶氧测定方法：用30ml细口瓶（具塞磨口瓶）作为水样瓶，用虹吸法取样一满瓶水样后，立即加硫酸锰3滴，碱性碘化钾3滴，盖上瓶盖（瓶中不可有气泡），上下摇动约1分钟。静置，待沉淀下降到中部后，加浓硫酸5滴，盖上盖再摇匀。取酸化后水样15ml于锥形瓶中，用0.050N硫代硫酸钠滴定到溶液为淡黄色时，加0.5淀粉56滴，再继续滴定到蓝色刚刚消失。记录滴定消耗体积V（毫升）。图 1 静水密闭法装置 图2流水密闭法装置6、耗氧率计算： NV 溶解氧

28、（mg/l）= _ 1000 V样 (初溶氧末溶氧)耗氧率（O2g/kg/h）= _呼吸室体积 （动物体重实验时间）五、思考题1、采用静水式和流水式方法进行耗氧率测定各有何优缺点？2、为何用静水式测定耗氧率要在一昼夜采取3-4个时间段测定，并取其平均值，为什么？3、温度和pH如何影响鱼类呼吸代谢？实验四 亚硝酸盐对鱼类血红蛋白的影响实验项目学时：3* 实验要求： 必修 选修 附件一 鱼类血红蛋白含量的测定（必修）方法一、酸化血红蛋白稀释测定法（改良沙利氏法）目的与原理 掌握测定鱼类血红蛋白含量的原理和方法，应用改良沙利氏法测定不同鱼类血红蛋白含量。本实验是应用比色法测定鱼的血红蛋白量。血红蛋白

29、本身的色泽，常随所结合的氧量多少而改变，不便比色。但是加入稀盐酸于血液中可使血红蛋白变成不易变色的高铁血红蛋白，这就可以与标准色相比，从而测出其含量。通常以每100ml血液中含血红蛋白克数来表示，正常鱼血红蛋白含量为7-8g。实验对象鲤、鲫或草鱼。实验设置四个组，即空白对照组和三个低中高浓度的亚硝酸盐实验组。试剂与器材 血红蛋白比色计，血吸管，注射器，凹瓷盘，小试管，试管架，蒸馏水，75%酒精，棉球，0.1mol/L盐酸，蒸馏水，滴管，纱布，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。实验步骤1、了解血红蛋白比色计的构成 血红蛋白计主要包括吸血管、比色计和比色管等部件。吸血管为一厚壁毛细玻璃管

30、，其上有10l、20l的刻度，尾端连有橡皮头，供吸血用。比色计的两侧，装有标准浓度的高铁血红蛋白溶液，也有用比色玻璃柱（或片）来代替的。比色管可插在比色计中，与两侧的标准比色柱进行比色。比色管的两侧通常刻有两行刻度。一行为血红蛋白的绝对值，以g计数（每100毫升血液中所含血红蛋白的克数）来表示，刻度范围为222。另一行为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，刻度范围为10%160%。目前测定常用绝对值来表示。 2、用蒸馏水将比色管洗净，吸血管则依次用蒸馏水，95%酒精和乙醚洗净干燥备用。3、用滴管加0.1mol/L盐酸46滴到刻度比色管内，约加到管下端刻度“2”或“10%”

31、处为止。4、采血：采血方法见前面的实验，用吸血管吸血至20l刻度（要准确）。用绵球仔细将管尖端外面的血拭去。5、将吸血管中血液轻轻地滴到比色管中盐酸底部，并用上层较清的盐酸溶液反复清洗吸血管3次。使吸血管内的血液完全洗净。切勿带入空气，以至形成气泡影响比色。吸血管尖端残留的液体，应在比色管内壁上沥净。取出吸血管后，轻轻摇动比色管使血液与盐酸充分混合，静置15分钟使管内的盐酸和血红蛋白作用完全，形成棕色的高铁血红蛋白。6、把比色管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。7、用吸管将蒸馏水逐滴地加入比色管内，每加一滴都应充分混匀并观察比色管内的颜色，直到

32、比色管内溶液的色度和血红蛋白计上标准色度相同时为准，读出管内液面所在的刻度数，（读数应以溶液凹面最低点相一致的刻度为佳）。即为每100ml血液中所含血红蛋白的克数（用g/100ml表示）。8、实验完毕应将吸血管和比色管洗净，放回盒内。方法评估 采用目视比色法测定血红蛋白含量是比较常用及简便的方法，但此法误差较大，而且同仪器的准确度有关。应用意义血红蛋白含量与年龄、性别、性周期、营养状况、活动情况、季节变化等有关，营养不良或长期饥饿可引起血红蛋白量显著降低。注意事项1、用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键。2、血红蛋白吸管很容易被

33、损坏，应妥善爱护。管内有凝血块时不可用金属丝疏通，可浸泡入氨水或45%尿素溶液中，待血块去除后再用水洗净，并按蒸馏水 95%酒精 乙醚的顺序清洗，最后吹干吸管。3、盐酸浓度不可过稀。血液与盐酸作用时间不可过短，必须在10分钟以上方可稀释比色，否则血红蛋白不能充分转变成高铁血红蛋白。最好在30分钟内比色完毕。4、滴加蒸馏水时，宜少量多次，逐滴加入后混匀比色，以免稀释过度，得不到准确结果。5、比色应在自然光线下进行，避免在阴暗处或有色灯光下比色，并将比色管刻度转向两侧，以免影响比色效果。实验五 设计性实验 水体污染对鱼类血液和脑组织胆碱能神经递质的影响 实验项目学时：8* 实验要求： 必修 选修

34、（一）实验目的及要求：掌握胆碱酯酶活力测定的原理和方法，并用羟胺三氯化铁显色法测定鱼类血液和脑组织中胆碱酯酶活力。多种神经毒物，如有机磷农药、氨基甲酸酯农药、毒扁豆碱及烟碱等对胆碱酯酶都具有强烈的抑制作用，从而破坏神经冲动的正常传递。因此，可以通过测定鱼类血液和脑组织中胆碱酯酶活力的抑制程度，了解水体受有机磷农药及其它污染的程度，同时掌握水体污染对鱼类的影响。（二）主要仪器设备分光光度计，恒温水浴，匀浆器，冰盘，解剖器械。 附件 鱼脑组织（或血液）胆碱酯酶活力的测定目的与原理掌握胆碱酯酶活力测定的原理和方法，并用羟胺三氯化铁显色法测定鱼脑胆碱酯酶活力。在神经冲动的传递过程中，乙酰胆碱是重要的化

35、学因素。在神经系统中，存在着催化合成乙酰胆碱的胆碱乙酰化酶和催化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶。 在一定温度、pH条件下，酶的反应速率与酶的量、反应速率，以及作用时间成近似的线性关系。通过测定所加入乙酰胆碱在胆碱酯酶作用下减少的量，就可得知胆碱酯酶活力的水平。未经胆碱酯酶水解的乙酰胆碱与羟氨作用生成乙酰羟氨，乙酰羟氨酸性条件下与三氯化铁(FeCl3)作用生成深褐色的络合物，其颜色与乙酰胆碱的浓度成正比，因而可以进行比色测定。试剂：1、磷酸盐缓冲液（pH7.2）（1）称取23.752克磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O） 溶于蒸馏水并稀释至1000ml。（2）称取18.156g磷酸二氢钾(KH2PO4)

36、 溶于蒸馏水稀释至1000ml。取（1）液72ml和(2)液28ml，混合即成。2、乙酰胆碱底物 称取乙酰胆碱0.0905g，加0.001M醋酸缓冲液（pH为4.5）至10ml，即成0.04mol贮备液，置冰箱内保存（不超过2星期）。临用时取0.04M贮备液1份，加9份磷酸盐缓冲液配制成0.004mol使用液。3、1M盐酸羟氨溶液 称取13.9克盐酸羟氨，溶于蒸馏水后稀释200ml。室温高于300C时，应置于冰箱内。4、14NaOH 称取14gNaOH，加蒸馏水溶解至100ml。5、10三氯乙酸溶液 称取10g三氯乙酸，溶于10N盐酸溶液，再稀释到100ml。6、10三氯化铁溶液 称取三氯化铁

37、10.0g，加0.83ml浓盐酸和10ml蒸馏水，待全部溶解后加蒸馏水到100ml。7、0.001mol醋酸缓冲液（pH4.5） 称取醋酸钠（NaAC3H2O）13.6g，加蒸馏水溶解后再稀释至100ml即成0.1mol。量取冰醋酸0.58ml加水至100ml即配成0.1mol。取前液57ml、后液43ml混合后再以蒸馏水稀释100倍即成。8、碱性羟胺溶液 临用前20分钟配制，将1mol盐酸羟氨与14NaOH液等体积混合即成。材料：鱼脑组织（或鱼血液）器材：分光光度计，恒温水浴，匀浆器，冰盘，解剖器械。实验步骤1、取新鲜或20冷冻鱼，从鱼头背面剖骨，仔细取出完整的鱼脑，用滤纸轻轻吸去表面体液，

38、剪碎、称重，在冰浴下加1毫升磷酸缓冲液匀浆，再用磷酸缓冲液稀释成每ml含2mg脑组织液。2、按下表加入试剂试剂试 管样品管对照管空白管标准管乙酰胆碱（ml）磷酸缓冲液（ml）鱼脑组织液（ml）1.01.01.02.01.01.03、准确保温（如20、25、或30）20分钟，取出试管，立即每管加碱性羟胺溶液4.0ml。充分摇匀，并在对照管加1ml鱼脑组织液。4、加10三氯乙酸溶液2.0ml，充分摇匀，然后每管再加10三氯化铁溶液2.0毫升，充分摇匀。5、各管试液用滤纸过滤，以除蛋白质。6、显色后将所得滤液置2cm比色管，在525nm波长下以空白管为0测量其余各管的光密度。（对照管光密度样品管光密

39、度）标准管光密度7、计算脑胆碱酯酶活力 4260/20（对照管光密度样品管光密度）标准管光密度= 6胆碱酯酶活力以每mg脑组织每小时催化水解乙酰胆碱的g分子数表示（g/mg/min）。方法评估本实验是采用测定酶作用后剩余基质的方法即羟胺三氯化铁法。由于乙酰胆碱酯酶的活力受基质浓度的影响，本法的消耗基质，应过量加入3070，在此范围外易产生误差。此方法在国内应用较普遍。应用意义多种神经毒物，如有机磷农药、氨基甲酸酯农药、毒扁豆碱及烟碱等对胆碱酯酶都具有强烈的抑制作用，从而破坏神经冲动的正常传递。因此，可以通过测定鱼脑胆碱酯酶活力的抑制程度，了解水体受有机磷农药及其它污染的程度，同时掌握水体污染对

40、鱼类等水生动物的影响。注意事项1、测定胆碱酯酶活力时温度、反应时间应严格控制。2、由于鱼脑胆碱酯酶的活力除受有机污染物影响外，水体中多种因素也对该酶有一定影响，正常鱼脑胆碱酯酶活力有30%的波动。因此测定时一定要有足够的样品数量，以保证实验结果的准确性。思考题1、试述胆碱酯酶的作用原理？2、取脑的酶组织液时为什么要用冰浴？3、当水体受有机磷污染时，鱼脑胆碱酯酶活力有何变化？为什么？实验六 几种激素对鱼类血糖调节的分析实验项目学时：5* 实验要求： 必修 选修 一、实验目的及要求：掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理和操作技术，并用此法测定鱼类等水产动物的血糖含量。掌握鱼类血糖调节的生理机制。二、实验基

41、本原理：鱼类的血糖受激素的调节而处于动态平衡之中。参与调节或影响血糖的激素很多，如胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素以及甲状腺、垂体、肾上腺皮质分泌的激素。测定血糖的方法很多，最精确的方法是葡萄糖氧化酶法。但是限于条件，本实验采用邻苯甲胺直接测定法。其原理是：血清中的葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合成蓝色（或蓝绿色）西夫氏碱。通过比色并与同样处理的标准液进行比较，便可计算出糖的含量。其反应如下：三、主要仪器设备及实验耗材：试剂：1、邻甲苯胺试剂：称取硫脲（A.R.）2.5g，溶于冰醋酸（A.R.）750ml中。将此溶液转入1L容量瓶内，加邻甲苯胺150ml，2.4硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至

42、1L刻度，置棕色瓶中，至少可应用2个月。2、葡萄糖贮存标准液（10mg/ml）：将少量无水葡萄糖（A.R.或C.P.）置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖1.000g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱中可长期保存。3、葡萄糖标准液（1.5mg/ml）：在100ml容量瓶内，加入葡萄糖贮存标准液15.0ml，用饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度，混和。4、0.1g/L肾上腺素：取肾上腺素0.01g加鱼用生理盐水100mL。5、胰岛素：用鱼用生理盐水配制成2.8710-7mol/L（20IU/mL）。6、糖皮质激素，胰高血糖素等。材料

43、：新鲜血清器材：可见分光光度计，1000w电炉， 试管及试管架，旋涡混合器，1000 ml烧杯 2个， 吸管(5ml 1支，0.1ml 若干或0.1ml可调移液器1支)，滤纸，擦镜纸，高速离心机，离心管等。四、实验内容或步骤：1、实验设置5组，即空白对照组（注射鱼用生理盐水），肾上腺素组（注射肾上腺素），胰岛素组（注射胰岛素），糖皮质激素组（注射糖皮质激素），胰高血糖素组（胰高血糖素）。每组6尾鱼。注射量为0.5mL/kg。采用腹腔注射方式，注射后立即放入水族箱中，经过1h、3h、6h、24h后取血样。分离血清。2、按下列方法进行血糖测定：1）样品测定准备好三只试管，分别标明空白管、标准管、测

44、定管，然后按表1-1-2加液。表1-1-2血液葡萄糖测定邻甲苯胺法操作步骤 空白管 标准管 测定管 mlmlml邻甲苯胺试剂 5.05.0 5.0血浆（或血清） 0.1葡萄糖应用标准液（1.5mg/ml） 0.1 蒸馏水 0.1 混合后置沸水浴中加热15分钟。取出，用流水或冷水浴冷却。用630nm或红色滤光片进行比色。以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。2）所得的光密度按下列公式计算血糖含量测定管光密度 / 标准管光密度150葡萄糖（mg/100ml）3）标准曲线绘制 取10ml容量瓶5个，分别编号1、2、3、4、5依次加入葡萄糖贮存液0.5、1.0、2.0、3.0、及4.0ml。再经饱和苯甲酸溶液稀释至10ml刻度，混和。以上溶液的葡