乳腺癌细胞培养(5页).doc

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1、-MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可， 1015的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化25min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。MDA-MB-

2、231 人乳腺癌细胞细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称 MDA-MB-231物种人细胞形态特征上皮样细胞生长特性贴壁生长细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-受体和WNT7B癌基因培养基 L15: Leibovitz Medium血清 10%FBS细胞传代方法 1:21:4传代；每周23次细胞传代情况 C5细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性说明培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养条件：37 5% C

3、O2消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min传代的比例：1：21：4换液时间：23天换液一次冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO冻存密度：1-2 10 6/管，液氮保存MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37水浴中，震荡解冻2min，酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入5ml37预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心（1000rpm，5min），弃去上清液，再加入2ml培养基，转入培养瓶中培养。产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst规格：7

4、0%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶特点：细胞代数为4-5代左右包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC货期：1-2周运输方式：快递运输售后：收到细胞后7天，如发现细胞有质量问题（如污染，死亡，快递运输等原因）时，应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员，我们将尽快为您解决。细胞培养常见问题分析细胞培养1、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管

5、之爆裂。2、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影

6、响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS （fetal bovine serum）和FCS （fetal calf serum）是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS （calf serum）则是指小牛血清。HS （horseserum）则是指马血清。6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定时应使用的CO2 浓度。当

7、培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。7、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。8、培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于20 ，避免反复冷冻解

8、冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg （约1,000rpm），5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长

9、之一重要原因。13、细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide）和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650），其本身即为无菌状况，次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少

10、污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 3060 分钟（-20 30 分钟*） -80 1618 小时（或隔夜） 液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 至80 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。15、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vi

11、al，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和配制是减低污染之方法。17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。18、支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。19、支原体污染会对有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及

12、研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次）以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。21、为何培养基保存于4 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？保存于4 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenol red）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。22、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？不同厂牌的dish

13、 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80太久。24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作

14、者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。25、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养首选AIM V（12005）（SFM）。26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能

15、量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。27、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。28、什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养

16、基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋

17、白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自中所有的二价离子。31、书上说，Hanks 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液（HBS）和Earles平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L）中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在基中储存的组织，用Hanks液就可以了。-第 5 页-