临床PCR实验攻略(13页).doc

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1、-临床PCR实验攻略 基础篇一、如何选择试剂，评价试剂是否符合自己实验室条件？现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒，那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏，而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别，如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要，一般来说，选择试剂主要从以下几个方面进行评价：1、重复性首先，试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏，是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。其次，我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性，而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。最后，试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大

2、的意义，一个重复性好的试剂，往往能够在病人的抗病毒治疗过程中，给医生和病人提供最直接、最可靠的数据，让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识，从而制定合理的治疗方案，实现更好的治疗效果。2、灵敏度一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度，同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说，我国的乙肝复发率远远大于发达国家，同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，这很大程度上与对低载量病毒监控的严重不足有关。美国肝病学会专家组就提出，对乙肝抗病毒治疗过程中，HBV DNA的最低监测点应设置为10IU/ml，而欧洲和亚太肝病学也指出HBV DNA病毒载量应

3、该尽可能小于10IU/ml。这都足以证明，高灵敏度对于用药治疗、病程监控等起着巨大的作用，灵敏度越高，对于疾病的监控效果更好，对于确定治疗的终点，具有积极的指导作用。3、定量准确性对于临床检测中定量项目来说，试剂盒定量的准确性是非常重要的，也是评价定量试剂盒的一个重要指标之一。卫生部每年都会有2次全国性的室间质评，通过质评结果可以很好的看出试剂盒定量的准确性。但往往很多时候，实验室在选择试剂的时候都偏重与过去的试剂盒比较定量结果的差异，并以过去的试剂盒定值作为标准来参考和评价一种新试剂，其实这种方法不完全可取。不过可以通过同时检测卫生部的质控品来进行比较，这样才使得两种试剂在同一客观标准上进行

4、PK，得到合理公平的评价。同时，要验证一个试剂的定量是否准确，我们可以采用一个高浓度样本，用阴性血清依次进行10倍梯度的稀释，然后选取多家试剂公司的产品进行同步检测PK，考察各公司试剂对样本定值的实际值与理论值的差异，即可判断各公司试剂定量准确与否。4、有无内标监测内标的一个最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，但在国内临床检测中往往被忽视了，这主要与两个方面有关，一个是之前国内使用的很多荧光定量PCR仪均为单通道的仪器，无法进行多色荧光的检测；国内外PCR行业对内标的研究已不是一个新兴课题，目前国内PCR行业能把内标做得非常好的科研单位或商业化的PCR试剂厂家寥寥无几，这正体现了这一技术的难

5、度。在临床检测中，内标的作用非常重要。在临床检测过程中，怎么做到每一个阴性结果均为真正的阴性结果，从而杜绝因扩增抑制而出现的假阴性结果呢？内标的加入就能够很好的防止假阴性结果了，加入我们做了一个样本，它的目标检测荧光为阴性，内标检测荧光也为阴性，那么这个样本的扩增则受到了抑制，该阴性结果为假阴性，我们必须对该样本进行复检。如果试剂没有内标的话，我们则不能很好的判断该结果是否正常？是否可以发报告？在发报告时，我们无法保证发出去的结果百分之百的准确；内标的加入，就可以解决我们这方面的烦恼。目前，卫生部的专家也在大力推崇内标的重要性，也是为了保证检验结果的准确可靠。 5、线性定量范围试剂盒的线性定量

6、范围指的是试剂盒最低检测下限和最高检测上限之间的范围，范围越宽说明试剂盒性能越好。 6、UNG酶防污染体系PCR反应过程中， 1个拷贝的DNA经过30个循环后，可以增长到10亿个拷贝的产物DNA， 极微量的PCR 产物污染，就可能造成假阳性，因而这是一个值得特别重视的问题。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：将PCR 产物中的dT用dU 代替。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响，UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中

7、的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。此外，试剂的稳定性、批间差、溯源性（是否溯源于WHO国际标准品）等也都是考察一款试剂盒质量重要指标。二、如何选择荧光定量PCR仪器？1、仪器使用的广泛程度如果不是一个新出现的仪器品牌，为保证所购置的仪器有充分的可靠性，临床PCR实验室可以从相应仪器在国内外使用的广泛程度来判断。应用越是广泛的仪器，越是经过实践验证的，也就越具有可靠性。2、仪器的检测通量（反应孔数）在购买定量PCR仪的时候需要根据实验室的要求来选择不同通量的仪器。目前市面上的荧光定量PCR仪的检测通量小到16多到384孔，实验室可以根据自己的检测项目和发展状况，选择合适的仪器，没必要追求最昂

8、贵的仪器，一般来说，96孔的通量足够用了；如需寻找新药靶点和疾病标记等类型的实验，则可以考虑购买384孔的仪器。3、仪器的通道数量随着医院开展的项目越来越多，比如基因表达，单核苷酸多态性分析、高分辨率熔解曲线等，那么单通道的仪器则无法满足实验室的需求了，而多通道的设计则能使其更方便地检测多重PCR检测及其衍生的基因表达等其他分析模式。4、耗材的开放性耗材如扩增反应管的开放性可能会决定日常检测成本的高低。作为临床PCR实验室，在选择实时荧光PCR仪时，可考虑这一点。不过对于检测HCV等RNA项目的时候，尽量使用去RNAnase酶耗材。5、硬件设计特点荧光定量PCR仪主要有96孔板式和离心式等，每

9、种设计都有它的独到之处，但也都有无法避免的缺陷。96孔板的荧光定量PCR仪可以容纳的样本量大，最大可至100ul，而且无需特殊的耗材。传统的96孔板仪器多采用卤钨灯激发、CCD检测。其优点在于：卤钨灯的光强比LED灯强，波长范围广，对于荧光染料的激发具有非常好的效果，性能比较稳定，使用寿命约3000个小时左右；但CCD的检测通常会因为每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同，会产生边缘效应，对结果产生一定的影响。为了保证精确、精准的实验结果，这类仪器在实验过程中通常需要配合ROX校正染料，来平衡孔间差异；离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测，设计上避免了边缘效应，同时PMT检测对荧光信号可

10、以放大或缩小，相对于CCD检测更加灵活，灵敏度更高；但LED的荧光强度比较弱，波长范围也比较窄，因此，对荧光染料的激发效果不如卤钨灯；6、运行速度在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，升降温速度也是非常重要的。更快的升降温，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合和反应时间，提高PCR的特异性。但是，运行速度越快，对加热制冷模块的要求越高，因此，稳定性是其存在的最大问题，如果在市面上经过长期考证的，稳定性好的仪器，运行速度越快，带来的便捷越多；7、灵活性在仪器基本性能得到保证的情况下，另外一方面则需要考虑仪器的灵活性，主要包括：仪器运输的灵活性，拆卸的灵活性，软件升级的灵活性，模块更

11、换的灵活性以及使用的灵活性等。三、临床基因扩增实验室硬件基本要求是什么？（1）实验室整体布局：根据卫生部颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号）要求，临床基因扩增检验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增区，产物分析区，也可以将后两个区域合为一个区，即扩增及产物分析区。实验室设计时按照办法规定，三个区域相互独立，并有各自的缓冲区域。（2）各工作区域仪器设备各工作区域的仪器设备及物品，包括椅子、办公用品、清洁用品等均不能拿出本区域，所有可移动物品均应有本区域的标示。各区域应具备的设备配置为：屋顶紫外灯、近台紫外灯、一次性手套、一次性鞋套、工作服

12、、废液缸、扫帚、拖把、废纸篓、微量加样器（覆盖1-1000ul），经高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）、笔、纸等。各工作区域的特殊配置包括：（1）试剂贮存和准备区：28冰箱、漩涡震荡器、超净工作台。（2）标本制备：28冰箱、-20冰箱、高速台式冷冻离心机、漩涡震荡器、金属加热模块、超净工作台。（3）扩增及产物分析区：荧光定量核酸扩增仪、电脑、打印机。 同时：进入各工作区域必须严格按照单一流向，并用明显的箭头表示，各区域用不同的颜色以示区别。即试剂贮存和设备区（蓝色）标本制备区（白色）扩增及产物分析区（粉色）。四、如何分析室内质控品的结果？采用Levey-Jerming质控图, 以X2SD警

13、告线，X3SD为失控线。质控点落在x3S之外时，首先采取的措施是复检，复检的目的主要是用于查明人为误差，也可以查出偶然误差，如果是偶然误差，重测的结果应在允许范围内。同时还在观察标准曲线的生成情况，扩增效率的高低，曲线梯并是否良好，曲线形态是否标准，Ct值是否有飘移，还要结合临床标本的检测结果，是否有高值和低值，来区分是试剂造成的失控还是操作不当、仪器故障或老化造成的失控。若临床标本测定结果的曲线标准，测量值有高有低，同时检测的试剂空白及阴性质控均在控，很有可能是标准品质量有问题，如降解、更换试剂型号等情况发生造成的。 对于连续7个质控点落在均值之一侧，若均未超出X3s范围时，认为存在系统误差

14、，但检测结果仍可发出；若连续7个质控点落在均值之一侧，而且质控数据有超出X3s范围的趋势时(逐渐升高或逐渐降低)，一定要联络仪器工程师，及时校准仪器。五、内标定量与外标定量对比？由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。内标定量：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，他们之间存在两

15、种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标，也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。外标定量：外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是与被测样品在相同条件下进行检测。由于在荧光定量PCR中，Ct值与起始模板的对数存在线性关系，因此可以利用标准曲线对未知样品进行定量测定，并且在PCR循环刚刚进入真正的指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的结果也会准确很多。美国Texas大

16、学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】六、IU/ml和copies/ml之间单位换算关系？首先简单来说，IU/ml和copies/ml是没有直接关系的，IU/ml是国际标准物质

17、的表述单位，copies/ml是各检测方法对结果的表述单位的一种，可参见李金明实时荧光PCR技术P177。所谓的International Unit（IU），是为了统一各个检测方法而设定的单位。本身PCR检测的拷贝数是无法绝对定量的，可以理解为，为了统一标准，WHO制定标准物质，赋予其IU值，发放给各个PCR试剂厂商，让他们把各自检测结果和标准物质比较，从而得出各自的换算系数。比如分发的是1IU的标准物质，罗氏测的是2copy，那罗氏的换算系数是2（2copies=1 IU），雅培的是20copy,那雅培的就是20（20copies=1 IU），由此可见，各个方法的转换系数是不一样的。其次，因

18、为各实验方法检测结果的表述单位存在多样化，如copies/ml，geq/ml等，使得检测结果没有可比性，因而WHO应用国际单位IU作为统一的表述单位，使不同实验室、不同检测方法得出的检测结果的表述单位得到统一并具有了可比性。最后，具体每种方法的检测结果与IU的关系，可以通过同时检测WHO的标准物质，然后根据其与标准物质的比例关系，来找到不同检测方法IU与copies之间的关系。 实验篇一、“假阴性”与“假阳性”结果如何判定？假阴性判断：造成假阴性结果的原因有很多，主要体现在FAM扩增曲线不起来，原因包括标本抑制，核酸提取失败，基因突变以及仪器故障等。目前国内主流PCR试剂都不带内标监控功能，用

19、于检测目标基因的FAM扩增曲线既用来定量又用于定性（判断阴阳性），因此FAM扩增曲线的好坏非常关键。对于此类无内标试剂，建议结合乙肝血清标志物结果（五项定量/定性结果）来判断阴阳性，即使是FAM曲线有扩增也应该参考此结果，特别是E抗原结果。同时，对于拥有竞争性内标监控功能的试剂来说，可有以下四种情况发生：如FAM无扩增，内标有扩增：结果正常，判断该样本为阴性结果；如FAM无扩增，内标也无扩增：结果异常，可能原因核酸提取失败或有抑制，一定要重复实验；如FAM有扩增，内标有扩增：结果正常，因为待测核酸和内标在同一反应体系下扩增；如FAM有扩增，内标无扩增：结果正常，强阳性样本会抑制内标的扩增，导致

20、内标结果偏弱或阴性。假阳性判断（如何判定）：临床PCR检测当中造成假阳性结果的情况比较少，原因包括试剂污染，气溶胶污染，操作污染，扩增产物污染，非特异性扩增，耗材污染等，所以建议一定要做阴性对照来监控是否存在污染。二、造成阳性样本漏检的可能原因有哪些？在临床PCR检测中，造成阳性样本漏检的原因很多，其中包括实验操作原因，试剂盒本身的原因，样本原因等等。第一：在实验操作过程中，核酸提取丢失或失败而导致漏检是比较常见的原因之一，如煮沸法试剂，要经过高速离心、吸去上清及高温煮沸等过程，很容易造成核酸的丢失，对于一些弱阳性样本，很可能因核酸丢失造成漏检；第二：由于试剂盒本身设计的缺陷，而导致对某种少见

21、基因型检测不出来情况，这是试剂盒设计的硬伤，因此检验者必须根据具体情况来选择合适的试剂进行检测；第三：操作过程中，因操作不规范，带入一些外源性抑制物，而最终导致PCR扩增失败或扩增受抑制。可见试剂盒方法学特点以及去抑制物能力对临床检验的重要性。另外，一些外源性抑制物也有可能导致扩增失败，比如手套的滑石粉，因此建议使用无粉手套，同时也要求操作者严格规范实验操作。三、PCR扩增曲线中，造成不规则扩增曲线的可能原因有哪些？实时荧光定量PCR扩增曲线包括基线期，指数扩增期，线性扩增期和扩增平台期，标准的曲线应该呈典型的S型。不规则曲线可以根据曲线的具体情况来分析：1）曲线呈斜线上升原因：热盖失灵或热盖

22、没盖紧，导致控温不准、液体挥发。解决办法:更换仪器热盖或将热盖盖紧。图1 曲线呈斜线上升2）扩增曲线分成两段（断裂）图2扩增曲线分成两段（断裂）原因：基线的终点大于Ct值，通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致曲线被压下去。解决方法：减小基线终点，至Ct值前4个循环，重新分析数据。3）直线扩增曲线图3 某些样本出现直线扩增曲线原因：探针部分降解解决办法:建议更换试剂进行测试。4）曲线平台期下掉原因：盖子没盖紧解决办法:PCR反应管盖子盖上后，检查盖子是否盖紧。图4曲线平台期下掉四、乙肝两对半的大三阳标本HBV DNA检不出怎么办？HBV-D

23、NA检查是反应乙肝病毒复制程度和传染性大小的最直接指标。临床数据显示，在乙肝两对半大三阳病例 中，HBV DNA阳性的检出率极高，但HBV DNA阴性的结果也是很有可能的。一般乙肝大三阳HBV-DNA阴性虽然表明患者病毒未超标，但大三阳结果提示患者感染乙肝病毒，且具有较强传染性。尽管如此，临床检验者也可能遇到大三阳标本HBV DNA检测不出的情况。首先对于这样的标本，可以将标本进行稀释后进行复查，排除血清或血浆标本中存在抑制物或者阳性标本HBV DNA浓度超过试剂盒上限而导致PCR扩增失败的情况。其次，乙肝病毒发生变异也是导致PCR扩增不出的原因之一，通常都是用药治疗患者的乙肝病毒核酸序列发生

24、了突变。如经过多种PCR试剂检测失败后，可进行DNA测序以确定乙肝病毒及其变异位点，以指导临床医生用药治疗。最后， 可更换另一厂家试剂进行检测，排除原试剂本身设计缺陷而造成漏检的情况。五、乙肝两对半全阴的标本HBV DNA结果呈阳性怎么办？国内外文献报道证实，乙肝两对半标志物全阴性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因为HBV DNA的检测窗口期出现早于乙肝血清标志物，因此此类患者可能处于乙肝感染早期。乙肝感染后，在乙肝“两对半”检测中，表面抗原HBsAg出现最早，一般在感染3周后出现，而HBV DNA的检测能将窗口期缩短至6-15天，乙肝两对半全阴的标本HBV DNA为阳性，是因为病人处

25、于感染乙肝病毒的初期，免疫学的检测窗口期比基因检测的窗口期长，导致两对半检测结果为阴性，由此可知：HBV DNA的检测，对于疾病的早期诊断有着非常重要的意义。六、怎样保证实验室的检测质量？1）为了保证检测质量，临床PCR实验室应有充分合理的空间，良好的照明和空调设备。工作环境虽不是检测质量的直接原因，但宽敞舒适的实验室环境将肯定有利于检验质量的保证。2）合理有效地对仪器设备进行管理，定期做维护和校准，使其处于一个良好的状态。例如，定期校准移液器，使其保持足够的准确度和精密度。定期维护荧光定量PCR仪的光学系统和反应孔间温度差异，使其保持在良好状态和允许的范围内。此外，还包括天平，离心机，冰箱等

26、设备的管理。3）理想的试剂：主要有内外两个因素，内在因素包括标本处理方法，用于核酸扩增的原材料及方法学设计等。外出因素包括试剂盒的运输和保存中的问题。4）标准化操作流程：完整的临床PCR程序由标本采集，运送，保存，编号，试剂准备，核酸提取，扩增和产物检测，结果分析和报告等诸多环节，建立科学和与本实验室配套的SOP文件，严格按SOP进行操作。5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有标本中的大量待测微生物，克隆质粒，大量存在实验室中的特定微生物以及以前扩增产物的残留污染等。这些都是实验室最容易造成假阳性的污染。因此，必须严格分区实验室及遵守工作流程，使用化学清洁实验台面，使用紫外线照射和U

27、NG方法消除扩增产物污染等等。6）进行室内和室间质量控制，室内质量控制可以确保实验室室内测定质量的一致性，室间质量控制可以提供将实验室测定情况与一室间和客观标准进行回顾性比较的数据。七、实验室扩增产物污染怎么办？答：如实验室的扩增产物泄露，造成实验室的污染，那么后果将非常严重。要去除污染，首先最重要的是保持通风，保证扩增产物片段能顺利扩散出去；其次可采用稀酸处理法，对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波长（nm）一般选择254/300nm，需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅

28、对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大；最后若污染长时间不能消除，建议更换另外厂家的PCR试剂进行检测，因为每个厂家的引物设计区域不一样；一般情况下，一家试剂公司的扩增产物不会在另外一家厂家的引物设计区域内，因此不会造成产物污染的假阳性。 仪器篇一、如何判断自己的PCR仪器荧光检测是否正常？要判断自己的PCR仪器是否正常，可从以下几方面考虑：1. 仪器开关机，与软件连接是否正常。2. 仪器运行同样的实验所需要的时间是否跟平时一致，由此判断仪器的加热制冷模块是否正常。3. 曲线结果是否呈明显的S型，若曲线异常，如呈曲折上升状，则可能是热盖问题，或者是荧光检测装置出现问题。4. 若曲线的荧光

29、值与平时相比，明显降低，则要考虑是否需要更换仪器光源（尤其是卤素灯，其光源寿命约2000h）。5. 若仪器某一孔或几孔的荧光值明显高于其他孔位，则需要考虑仪器的孔槽或检测光路是否受到荧光污染，建议清洗仪器孔槽后再进行测试。二、PCR仪器运行中突然断电怎么办？答：通常我们建议在实验室配备UPS电源，这样能够保证PCR仪器运行过程中的正常供电，从而保证程序的正常运行。PCR仪器在运行中突然断电的话，如仪器有断电保护功能，则可直接继续运行程序。如实验室无UPS电源，突然断电而导致PCR程序不能完成，为了保证实验结果的真实性，建议只能重复实验再上机检测。三、PCR仪器的热盖坏了怎么办？答：荧光定量PC

30、R仪的热盖失效或故障最主要的表现是：控温不准和液体挥发，反应液挥发会最终导致曲线不扩增，呈斜线上升。首先可通过曲线判断热盖是否故障，若确定热盖已经坏了，建议可以在每个PCR反应管中加入一层矿物油（矿物油可避免反应液挥发），上机测试曲线结果是否正常。如曲线仍然异常，则建议请仪器工程师现场维修，甚至直接更换热盖。四、PCR仪器有哪些常见的小问题？如何解决？答：PCR仪器常见的小问题有如下几点：1. 打开电源但是仪器不响应。这种情况很可能是由于电源线脱落或者没有插紧而致，将电源线重新插入插座即可排除故障。2. 仪器和软件无法正常连接。建议打开仪器电源，让仪器通过自检后，再打开软件；因为仪器在自检过程

31、中，很容易导致软件连接不上。另外，若仪器和软件仍连接不上，检查连接线是否插紧，再重启软件。3. 仪器加热或冷却速度缓慢。PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当PCR仪的降温过程超过60s，就应该检查仪器的制冷系统，对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘；对其他制冷系统应检查相关的制冷部件，最好找仪器工程师进行维护。4. 热盖控温失灵。这种情况可能会导致实验运行的曲线结果很乱，不呈S型，且运行结束后，会发现PCR反应管的侧壁甚至顶部有很多液滴，这样会导致荧光采集光路发生变化，曲线结果异常。5. 仪器加热模块的孔槽被污染，导致一个或多个孔的荧光值很高。结果运行完成

32、后，发现某个孔位的荧光值本底明显高于其他孔位，则要考虑该孔是否被污染，最好对仪器孔槽进行清洁。先打开盖子，然后用无水乙醇浸泡样品池5min，然后用移液器吸去液体，再加入去离子水进行二次清洁，用移液器吸去液体；打开PCR仪，设定保持温度为50的PCR程序并使之运行，让残余液体挥发去除，一般510min即可。五、PCR反应管上面做标记对结果有何影响？答：我们不建议在PCR反应管上用记号笔做任何标记。据李金明教授的实时荧光PCR技术一书上的P100记载：反应管用记号笔做标记，加热将使颜料挥发，进而污染光路部分影响检测。六、PCR反应管为什么不放在仪器孔槽的边缘？答：主要原因大致分为一下两点：CCD检

33、测系统：对于采用CCD检测系统而不是PMT或者其他检测系统的荧光定量PCR仪器来说，由于曝光和成像原理，使得采集到的信号中间强，两边弱，即我们常说的边缘效应，因此对于此系统，将反应管放在仪器中间是比较好的；对于采用热盖加热或保温的仪器，如果PCR管单独放在仪器孔槽的一边，容易让热盖倾斜，也会对实验产生细微的影响，因此放中间也好些。 圣湘篇一、圣湘HBV一步法操作过程有什么需要注意的地方？答：操作圣湘HBV一步法主要有如下需要注意的地方：1.使用校准过的移液枪，建议取核酸释放剂和样本的移液器量程最大为10ul，加反应液的移液器量程最大为100ul。2.加核酸释放剂可以使用一个移液枪头，建议采用深

34、吸浅打的连续加样方式（具体操作方式见后图说明）。3.标准品和样本使用前先混匀并瞬时离心，加标本或标准品的时候，加一个样换一个枪头，建议枪头伸到底部吹打3次，力度均匀避免产生气泡。4.加完标本或标准品并吹打三次后，建议等待10分钟后再加反应液，如一次做的标本量在32个以上则不需要等待。5.加反应液的时候，加一个样本换一个移液枪头，避免污染！枪头需伸入到八连管内部靠壁加入，最好不要悬空加。6.样本和反应液都可以采用浅吸深打的加样方式（具体操作方式见后图说明）。7.加完反应液后，无需等待，盖上盖子，即可上机。移液器的两个档位：1档、2档a. 核酸释放剂深吸浅打：调节移液器至5ul，吸液时按到2档，伸

35、入核酸释放剂的试剂管中，松开移液器，即取到液体。将核酸释放剂加入八连管中时，按到1档打出去，此时打出去的液体刚好为5ul。手不要松开，此时枪头中还剩下一部分液体，再将此枪头伸入试剂管中松开，即第二次取液，按1档将液体打入八连管，如此下去将核酸释放剂均加入八连管。到最后一个孔时还剩余小部分核酸释放剂，可以舍弃掉，如确定没有被污染，可以打回试剂管中。b. 样本和反应液浅吸深打：即常规的加液方式，加样本时，调节移液器至5ul（若是反应液则是40ul），吸液时按到1档，伸入试剂管中，松开移液器，取到液体。将试剂加入八连管中时，按到2档完全将液体打出去。换一个枪头加其他的样本或试剂。二、HBV一步法加5

36、ul样本是否太少了？答：传统的煮沸法过程是：取100ul血清样本与100ul处理液A，经高速离心、浓缩去上清后，加入25ul处理液B，最后取2l DNA提取物上样；通过反推法，煮沸法相当于取了8l原始样本。我们综合考虑煮沸法的提取过程，首先，在高速离心浓缩病毒时，对于高浓度的样本，病毒沉淀不完全，容易造成第一次核酸丢失；其次，在去除上清液的过程中，因为我们无法清楚地看到离心管中的沉淀，枪头极有可能碰到底部的病毒，导致带出病毒，造成核酸的第二次丢失；再次，在高温加热煮沸过程中，蛋白质高温变性，成为凝胶状，可能导致在第三步的高速离心中，凝胶状的蛋白包裹核酸，沉降到离心管底部，造成核酸的第三次丢失。

37、综合可知：煮沸法的8ul上样量是不准确、不真实的。反观圣湘一步法，其原理是取5ul核酸释放剂和5ul血清，直接加到PCR反应管中，病毒裂解，核酸释放出来。核酸释放剂的裂解作用非常强烈，能够使核酸完全释放出来，核酸无需进行提取，没有损失，5ul血清中的病毒全部进入扩增，保证了定量的准确性。三、磁珠法的原理是什么？磁珠法是采用纳米磁珠提取血清或血浆样品经裂解后释放出的的核酸，利用针对核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现核酸的定量检测。简单步骤：加溶液1加样本加溶液2弃废液加溶液3和4弃废液加

38、反应液上机。核酸提取溶液1含十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、异硫氰酸胍等主要是裂解、释放核酸的作用；核酸提取溶液2内含磁珠颗粒，磁珠经过特殊的修饰，能够特异性吸附核酸。溶液3主要是无机溶液，主要是清洗吸附了核酸的磁珠，去除杂质。溶液4为矿物油，能够去除能溶于有机相的杂质，同时，在去除废液时，能更好的排除溶液3对扩增的影响。四、ROX校正有何作用？答：通常我们在进行PCR的操作时，无法保证每个样本的加样量是完全一致的，每个样本之间都会有细微的差别，同时，因为仪器的温控和光源系统都会存在不同程度的边缘效应，导致模块的每个孔间都存在差异。反应液中ROX的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关，因此ROX可用于消除用枪操作误差、耗材PCR反应管的管盖、管壁的厚度差异，同时可校正仪器的孔间温差以及光源的边缘效应造成的光学误差，减少孔间差异，提高数据重现性和精确度，使定量更准确。-第 13 页-