动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告(共13页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleicacid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高

2、温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开也称为DNA的解螺旋。在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，

3、进而调节基因的转录。脱氧核糖核酸的结构DNA的结构： DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模

4、板转录出一段称为mRNA（信使RNA）的核酸分子。DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3， 5-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体X174、G4、M13等。DNA有环形DNA和链状DNA之分。在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期，查加夫（E.Chargaff）发现不同物种DNA的碱基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（A=T），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用

5、几个层次描绘DNA的结构。浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14 M的盐溶液中溶解度很低，而RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20

6、-30/加(微米)，有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、内质网、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14 M的盐溶液中溶解度很低，而RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋

7、白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。四、实验器材和材料试剂实验器材： 匀浆器 量筒 离心机 离心管 试管 吸管 恒温水浴锅实验材料： 猪肝实验试剂： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠溶液（pH6.8） 95%乙醇（A.R.） NaCl固体（A.R.） 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml） V(氯仿)：V（异戊醇）20：1的混合液五、实验操作1.称量称取一定质量的猪肝，加入2倍肝重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎（已完成）。2.提取DNA量取肝糜4 ml 于10毫升离心管，在4000r/min

8、下离心10min ，沉淀中再加入8 ml缓冲液于4000r/min离心5 min；弃上清，取沉淀；将沉淀用10 ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5 ml 氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS，振荡30min（保鲜膜封口）；缓慢加入固体NaCl（约0.9g），使其最终浓度为1mol/L；将溶液分装到2个10毫升离心管中，在4000r/min离心5 min，取上清水相；在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品；用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中。3.标准曲线的绘制按下表加入各种 试

9、剂，混匀，于60恒温水浴锅45min，冷却后，在595nm波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制作标准曲线。012345标准DNA溶液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸馏水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4.样品的测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于60恒温水浴锅45min，冷却后，595nm波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量（ug）。5.计算100g猪肝中DNA

10、含量w=m1/m2100%w：DNA的质量分数（%）m1：样液中测得的DNA的质量（ug）m2：样液中所含样品的质量（ug）六、实验数据处理1.标准曲线012345标准DNA溶液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸馏水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA含量/ug0801602403204002.实验结果处理猪肝质量为2.04gDNA提取液体积为12.53ml序号123A595nm0.1020.1020.101平均A595nm0.102样液中DNA含量/ug171.

11、4样液中样品质量/g0.1628根据公式w=m1/m2100%得：w=0.1053则100g猪肝中DNA含量为：w100=0.1053g七、思考题1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？答：柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂，也是pH缓冲溶液；SDS是表面活性剂，可以让蛋白质与DNA分开；氯仿是有机溶剂，可以使蛋白质聚集沉淀，便于分离出去；异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；氯仿-异戊醇的作用是使、膜溶解；NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的环境中DNA核蛋白能溶解，RNA核蛋白则溶解度很低，可以利用这一性质分离两种核酸。八、实验注意事

12、项1.DNA主要集中在细胞核中，因此，通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料，小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而DNA含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备过程中DNA被降解的可能性相对较低，所以是制备DNA的良好材料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备DNA常用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行，可加入某些物质抑制核酸酶的活性，如柠檬酸钠、EDTA、SDS等，EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法

13、、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚，并释放出核酸。4.使用离心机时，对称放置的离心管必须用天平调平衡。5.避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析，得出100g猪肝中DNA含量大约为0.1053g的结论，在上网查阅相关资料后发现：猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。由此可知，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术，基本达到了本次实验的目的。但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA的含量，且实验数据较理论

14、值偏低，这是由于某些误差导致，在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差，经分析得出以下几点：在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中，由于猪肝组织表面较滑不易磨碎，且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留，因此可能导致猪肝中DNA提取不充分，致使实验数据较理论值偏低；研磨过程中，可能由于操作不当，导致部分液体溅出，因此可能使得提取液中部分DNA损失，导致实验数据偏低；在粗提取DNA操作中，频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内，可能有极小部分DNA提取液未倒净，残留在仪器壁上损耗掉，导致实验误差；在使用移液枪的过程中，可能因为操作不当或移液枪经常错误使用，出现仪器误差，导致吸取的DN

15、A样液不精确，出现实验误差；在水相中加入乙醇析出DNA时，不是所有DNA均析出，有小部分依旧融在溶液，导致提取出的DNA含量偏低；标准曲线制作过程中出现些许误差；总的来讲，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术，基本达到了本次实验的目的。在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性，严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行，保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低，尽可能达到预期的实验效果，完成自我的学习及锻炼过程。公司档案管理制度一、总则1、为加强本公司档案工作，充分发挥档案作用，全面提高档案管理水平，有效

16、地保护及利用档案，为公司发展服务，特制定本制度。2、公司档案，是指公司从事经营、管理以及其他各项活动直接形成的对公司有保存价值的各种文字、图表、声像等不同形式的历史记录。公司档案分为受控档案和非受控档案。3、公文承办部门或承办人员应保证经办文件的系统完整(公文上的各种附件一律不准抽存)。结案后及时归档。工作变动或因故离职时应将经办的文件材料向接办人员交接清楚，不得擅自带走或销毁。二、文件材料的收集管理1、公司指定专人负责文件材料的管理。2、文件材料的收集由各部门或经办人员负责整理，交总经理审阅后归档。3、一项工作由几个部门参与办理的，在工作中形成的文件材料，由主办部门或人员收集，交行政部备案。

17、会议文件由行政部收三、归档范围1、重要的会议材料，包括会议的通知、报告、决议、总结、典型发言、会议记录等。2、本公司对外的正式发文与有关单位来往的文书。3、本公司的各种工作计划、总结、报告、请示、批复、会议记录、统计报表及简报。 4、本公司与有关单位签订的合同、协议书等文件材料。5、本公司职工劳动、工资、福利方面的文件材料。6、本公司的大事记及反映本公司重要活动的剪报、照片、录音、录像等。四、归档要求1、档案质量总的要求是：遵循文件的形成规律和特点，保持文件之间的有机联系，区别不同的价值，便于保管和利用。2、归档的文件材料种数、份数以及每份文件的页数均应齐全完整。3、在归档的文件材料中，应将每

18、份文件的正件与附件、印件与定稿、请示与批复、转发文件与原件，分别立在一起，不得分开，文电应合一归档。4、不同年度的文件一般不得放在一起立卷；跨年度的总结放在针对的最后一年立卷；跨年度的会议文件放在会议开幕年。5、档案文件材料应区别不同情况进行排列，密不可分的文件材料应依序排列在一起，即批复在前，请示在后；正件在前，附件在后；印件在前，定稿在后；其它文件材料依其形成规律或应保持文件之间的密切联系并进行系统的排列。6、案卷封面，应逐项按规定用钢笔书写，字迹要工整、五、档案管理人员职责1、按照 有关规定做好 文件材料的收集、整理、分类、归档等工作。2、按照归档范围、要求，将文件材料按时归档。3、工作

19、人员应当遵纪守法、忠于职守，努力维护公司档案的完整与安全。1、公司档案只有公司内部人员可以借阅，借阅者都要填写借阅单，报主管人员批准后，方可借阅，其中非受控文档的借阅要由部门经理签字批准，受控文档的借阅要由总经理签字批准。2、档案借阅的最长期限为两周；对借出档案，档案管理人员要定期催还，发现损坏、丢失或逾期未还，应写出书面报告，报总经理处理。走在路上，挫折是难免的，低潮是必然的，孤独与寂寞是如影随形的;总有被人误解的时候，总有寄人篱下的时候，总有遭人诽谤与暗算的时候。这些时候，要知道潮涨潮落、波谷波峰的道理，只要你能够耐心等待，受得了折磨，守得住底线，一切都会证明，生活不会抛弃你，命运不会舍弃你。专心-专注-专业