单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

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1、第四章第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节第一节 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存第二节第二节 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性四、单克隆抗体的特性第三节第三节 基因工程抗体制备基因工程抗体制备 一、人源化抗体一、人源化抗体 二、小分子抗体二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白 四、双

2、特异性抗体四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体库技术五、噬菌体抗体库技术第四节第四节 单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用 一、检验医学诊断试剂一、检验医学诊断试剂 二、蛋白质的提纯二、蛋白质的提纯 三、小分子抗体的应用三、小分子抗体的应用 四、抗体融合蛋白的应用四、抗体融合蛋白的应用 五、双特异抗体的应用五、双特异抗体的应用 六、抗体库技术的应用和前景六、抗体库技术的应用和前景思考题思考题小结小结 第一节第一节 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：杂交瘤技术原理：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合

3、胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HATHAT培养基的选择培养：培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤增殖的杂交瘤 细胞系细胞系单克隆抗体生成：单克隆抗体生成：接种杂交瘤接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体中即可得到高效价的单克隆抗体抗体种类：抗体种类：第一代抗体第一代抗体 多克隆抗体多克隆抗体（polyclonal antibody)第二代抗体第二代抗体 单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody)第三代抗体第三代抗体 基因工程抗体（基因工程抗体（genetic engineering antib

4、ody)B B淋巴细胞淋巴细胞: :寿命短寿命短, ,分分泌特异系性抗体泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：寿命长寿命长杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：寿命长，寿命长，单克隆抗体单克隆抗体流流程程一、杂交瘤技术一、杂交瘤技术不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞（一）小鼠骨髓瘤细胞 动动 物：物：BALB/BALB/c c小鼠小鼠7 71212周龄周龄20g20g25g25g体重体重（二）免疫脾细胞（二）免疫脾细胞细胞性抗原：细胞性抗原：（1 12 2）10107 7/ /只，不加佐剂，只，不加佐剂

5、，2 23 3周重复一次周重复一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂首次，完全福氏佐剂+100+100微克抗原，微克抗原，3 36 6周周100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加强免疫天，加强免疫免疫小鼠免疫小鼠。淋巴细胞淋巴细胞。淋巴细胞发育淋巴细胞发育。浆细胞浆细胞。抗原接种抗原接种培养液：培养液：RPM1640培养液培养液DMEM培养液培养液（三）细胞融合（三）细胞融合细胞融合剂：细胞融合剂：PEG:分子量分子量4000 的的PEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂作用机理：作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞诱导细胞膜上脂类物质结构重

6、排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合膜易打开而有助于细胞融合作用特点：作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEGPEG，其纯度与毒性有所不同，其纯度与毒性有所不同培养骨髓瘤细胞：培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用避免细胞返祖：定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于于-80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：免疫

7、脾细胞的制备：1 110108 8的淋巴细胞的淋巴细胞 无菌手术无菌手术饲养细胞：饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中其中MQMQ还有清除死亡细胞的作用还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过饲养存活一般不超过2 2周，不影响杂交瘤细胞周，不影响杂交瘤细胞的纯化的纯化。饲养细胞饲养细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)(1:3)50% PEG 1min50% PEG 1min内加完内加完; ;2min2min内加内加10ml10ml培养液培养液融合方法融合方法SP2/0SP2/0细胞与脾细

8、胞的比例为细胞与脾细胞的比例为1 1：2 25 51ml 50%1ml 50%的的PEGPEG（无菌，预温（无菌，预温3737）在）在1 1分钟内滴完分钟内滴完, ,静置静置9090秒秒, ,时间一到时间一到, ,将事先准备的培养液一滴一滴加入将事先准备的培养液一滴一滴加入, ,停止停止PEGPEG作用作用根据细胞数量加入根据细胞数量加入HATHAT培养基，使之分加到培养基，使之分加到9696孔板中时每孔孔板中时每孔细胞数为（细胞数为（0.50.51.51.5）10105 5个。融合后个。融合后7 7天，换用天，换用HTHT培养液培养液细胞融合细胞融合10102020天出现克隆天出现克隆HAT

9、HAT筛选筛选挑克隆挑克隆融合细胞的早期培养融合细胞的早期培养HGPRTHGPRT酶与酶与TKTK酶酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：应用液：8-8-杂氮鸟嘌呤杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇聚乙二醇HATHAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断阻断DNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸前核苷酸前体体”，供细胞通过替代途径合成，供细

10、胞通过替代途径合成DNADNAHATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的合成的主要途径被主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻SP2/O: HGPRT- ，TK-;长长命命脾细胞脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命短命(7天天)杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长长命命骨髓瘤细胞、脾细胞与骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交杂交瘤细胞瘤细胞杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：长期生长繁殖长

11、期生长繁殖利用淋巴细胞的利用淋巴细胞的HGPRT，将，将H合成为嘌呤合成为嘌呤碱并最终与碱并最终与T一起合成一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法显微操作法(micromanipulation)FACS法法（fluorescence activated cell sorter）软琼脂平板法软琼脂平板法(soft agar method) 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存特点：特点

12、：不需任何特殊设备不需任何特殊设备克隆出现效率高克隆出现效率高实验室常用方法实验室常用方法方法：方法：细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.50.51 1个细胞个细胞有限稀释法有限稀释法效率最高效率最高价格昂贵价格昂贵FACS配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml) + /ml) + 细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40% 40% 牛血清，牛血清，50%50%60% RPMI-164060% RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO )10%DMSO )“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70

13、液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义细胞冷冻的意义 第二节第二节 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产

14、生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。备单克隆抗体。 一、单克隆抗体的产生一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：动物体内诱生方法：每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/ /只只体外培养法：体外培养法：中空纤维培养系统中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清单抗含量不高，牛血清AbAb难以去除难以去除腹腔注射法腹腔注射法前前5 5天进行天进行, ,预先腹腔注射预先腹腔注射pristanepristane（1 15 5）1

15、0106 6细胞细胞1 13w3w形成腹水形成腹水高滴度腹水高滴度腹水可溶性抗原：可溶性抗原：ELISAELISA抗体捕获法抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法免疫荧光法（用丙酮和甲醇按（用丙酮和甲醇按1:11:1比例固定细胞）比例固定细胞）二、二、 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化ELISAELISAELISAELISA多头加样枪多头加样枪。免疫荧光法免疫荧光法盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAbMcAb的纯化的纯化 IgIg类型、亚类测定：类型、亚类测定：双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定：特异性测定：抗原类

16、似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定：效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的, ,用竞用竞 争抑制争抑制法，相加指数法及微机集群分析法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：亲和性测定：测定亲和常数测定亲和常数K K杂交瘤细胞染色体：杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条，条，SP2/0SP2/0细胞细胞6868条，杂交瘤细胞一般条，杂交瘤细胞一般100100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western b

17、lotwestern blot三、三、 单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性四、单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环境敏感性（一）单克隆抗体的特性（一）单克隆抗体的特性优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫

18、显像和免疫导向治疗（二）单克隆抗体的优点与局限性（二）单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高 McAbMcAb Pc PcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不纯可以不纯 纯度高纯度高得量得量 高高 低低特异性特异性 高高 低低 稳定稳定 低低 高高 沉淀反应沉淀反应 无无 有有成本成本 高高 低低McAbMcAb与与PcPcAbAb的比较的比较McAb and PcAb第三节第三节 基因工程抗体制

19、备基因工程抗体制备基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。价抗体和双特异性抗体。 将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交

20、瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体一、人源化抗体一、人源化抗体方法：方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人IgIg恒定恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人- -鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体特点：特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体嵌合抗体嵌合抗体定义：定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V

21、 V）中互补）中互补决定簇（决定簇（CDRCDR）序列改换成鼠源单抗）序列改换成鼠源单抗CDRCDR序列。重构成既具序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAbRAb亦叫亦叫“重构型抗体重构型抗体”，因其主要涉及，因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”，又可称为又可称为“CDRCDR移植抗体移植抗体意义：意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗（二）改型抗体（二）改型抗体FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链

22、可变区片段SdAbSdAb：单区抗体单区抗体 二、小分子抗体二、小分子抗体小分子抗体小分子抗体其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。取得杀伤肿瘤

23、细胞的作用。四、双特异性抗体四、双特异性抗体 分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb，使各抗体，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。产物均一性不佳。化学交联化学交联BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞但二

24、次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAbBsAb在其中在其中的比例可为的比例可为10%10%50%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAbBsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)(HAMA)，因此不适用于临床。，因此不适用于临床。细胞工程细胞工程BsAb 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段, ,如如FabFab，FvFv或或ScFvScFv, ,经基因操作修饰后经基因操作修饰后, ,或体或体外组装为

25、外组装为BsAbBsAb, ,或直接表达分泌型或直接表达分泌型的的BsAbBsAb。基因工程基因工程BsAb定义：定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在完全人源性的抗体，在HIVHIV等病毒感染和肿瘤的诊断等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性与治疗方面有其独特的优越性 五、噬菌体抗体库技术五、噬菌体抗体库技术用用PCRPCR扩增人抗体重链可变

26、区扩增人抗体重链可变区(VH)(VH)和轻链可变区和轻链可变区(VL)(VL)基因基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将组合抗体文库：在建库过程中如果将VHVH和和VLVL随机组合随机组合 人天然抗体库：抗体人天然抗体库：抗体mRNAmRNA来源于未经免疫的正常人来源于未经免疫的正常人（

27、一）基本原理和程序（一）基本原理和程序噬菌体抗体库噬菌体抗体库 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B B淋巴细胞，提取淋巴细胞，提取mRNAmRNA并逆转录为并逆转录为cDNAcDNA； 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCRPCR技术扩技术扩增不同的增不同的IgIg基因片段；基因片段； 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库菌体抗体库(surfa

28、ce display antibody library)(surface display antibody library)常用载常用载体；体； 表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附合吸附- -洗脱洗脱- -扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 构建噬菌体抗体库构建噬菌体抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过10111011库容库容, ,能包含能包含B B细胞全部克隆细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总建库的外源基因来自人体多克隆

29、细胞的总mRNAmRNA通用引物具有人的种属普遍性通用引物具有人的种属普遍性抗体的抗体的VHVH和和VLVL基因的随机重组也增加了抗体的多样性基因的随机重组也增加了抗体的多样性（二）噬菌体抗体库技术的特点（二）噬菌体抗体库技术的特点避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体VHVH和和VLVL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体所用的抗体基因又来自人体第四节第四节 单克隆抗体的应用单克隆抗体

30、的应用检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂蛋白质的提纯蛋白质的提纯小分子抗体的应用小分子抗体的应用抗体融合蛋白的应用抗体融合蛋白的应用双特异抗体的应用双特异抗体的应用抗体库技术的应用和前景抗体库技术的应用和前景病原微生物抗原、抗体的检测病原微生物抗原、抗体的检测肿瘤抗原的检测肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的的检测免疫细胞及其亚群的的检测激素测定激素测定细胞因子的测定细胞因子的测定一、检验医学诊断试剂一、检验医学诊断试剂 病原体测定：病原体测定：肝炎病毒肝炎病毒HAV,HBV,HCV,HDV,HEVHAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCHTORCH弓形虫弓形虫, ,风疹病毒风疹病毒, ,巨细

31、胞病毒巨细胞病毒 ，单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒细胞表面细胞表面CDCD测定：测定：CD4/CD8:CD4/CD8:Th/TcTh/Tc白血病的分型白血病的分型激素的测定：激素的测定：内分泌疾病的诊断内分泌疾病的诊断药物测定药物测定(TDM)(TDM)：抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛研究工作中的探针：研究工作中的探针：越来越多未知功能越来越多未知功能cDNAcDNA的克隆的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加免疫沉淀免疫沉淀二、蛋白质的提纯二、蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆单克隆抗体是亲和层析中

32、重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。MACS定义：定义： 分子量较小但具有抗原结合功

33、能的分子片段分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段优点：优点：分子量小分子量小, ,穿透性强穿透性强, ,抗原性低抗原性低不含不含FcFc段，不会与带有段，不会与带有FcFc段受体的细胞结合，不良反应少段受体的细胞结合，不良反应少可在原核系统表达及易于基因工程操作可在原核系统表达及易于基因工程操作半衰期短，有利于及时中和及清除毒素半衰期短，有利于及时中和及清除毒素三、小分子抗体的应用三、小分子抗体的应用 应用：应用：用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布基因治疗基因治疗细胞内抗体：细胞内抗体：在细胞内表达在细胞内表达特异性识别某一基因产物特异性识别某一基因产物可干扰该

34、基因产物的生物活性可干扰该基因产物的生物活性研究基因结构与功能的关系研究基因结构与功能的关系肿瘤的体内显像诊断肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体理想的显像定位诊断载体病毒的诊断和抗病毒感染病毒的诊断和抗病毒感染血液性疾病的诊断血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型白血病的免疫诊断及分型四、抗体融合蛋白的应用四、抗体融合蛋

35、白的应用在体外免疫检测中的应用在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验自身红细胞凝集试验 快速检测快速检测HBVHBV和和HIVHIV病原体等病原体等 避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml1ng/ml五、双特异抗体的应用五、双特异抗体的应用在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用方法：方法： 双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性合半抗原螯合剂，

36、后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示核素结合，利用二次导向系统显示特点：特点： 更高的的灵敏度和清晰度更高的的灵敏度和清晰度在体内免疫治疗中的应用在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞胞毒物质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种抗体还可与携带药物的脂质体、各

37、种PEGPEG偶联，从而增偶联，从而增强体内运输和药代动力学强体内运输和药代动力学六、抗体库技术的应用和前景六、抗体库技术的应用和前景在肿瘤体外诊断中的应用在肿瘤体外诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用在肿瘤治疗中的应用在肿瘤治疗中的应用 1 1杂交瘤技术是如何问世的？其基本原理是什么？杂交瘤技术是如何问世的？其基本原理是什么？2 2什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗 体有何异同？体有何异同？3 3杂交瘤细胞的克隆方法有哪些？杂交瘤细胞的克隆方法有哪些？4 4细胞株冻融的原则是什么？细胞株冻融的原则是什么？5 5大量制备

38、单克隆抗体的方法有哪些，各有哪些优缺点？大量制备单克隆抗体的方法有哪些，各有哪些优缺点？6 6单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些？单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些？7 7叙述单克隆抗体的制备流程和应用。叙述单克隆抗体的制备流程和应用。8 8叙述基因工程抗体的概念和优点。叙述基因工程抗体的概念和优点。9 9基因工程抗体的种类和应用。基因工程抗体的种类和应用。1010抗体库技术的原理和特性有哪些？抗体库技术的原理和特性有哪些？思考题思考题小结小结 杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

39、胞与具有在胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一 体，在体，在HATHAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）养（克隆化）, ,最终获得既能产生所需单克隆抗体最终获得既能产生所需单克隆抗体, ,又又能不断繁殖的杂交瘤能不断繁殖的杂交瘤 细胞系，将这种细胞扩大培养，细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。的

40、单克隆抗体。 20 20世纪世纪8080年代诞生了应用年代诞生了应用DNADNA重组及蛋白工程技重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体，它具有如下优点：工程抗体，它具有如下优点：通过基因工程技术通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；部位；根据治疗的需要，制备新型抗体；根据治疗的需要，制备新型抗体；可以可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。