DNA染色实验(3页).doc

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1、-DNA染色实验-第 3 页DNA染色实验1、原理与解析 (1)真核细胞的DNA主要分布在细胞核内，RNA主要分布在细胞质中。 (2)甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿对DNA亲和力强，使DNA显现出绿色，而吡罗红对RNA的亲和力强，使RNA呈现出红色。用甲基绿、吡罗红的混合染色剂将细胞染色，可同时显示DNA和RNA在细胞中的分布。(同时甲基绿用二苯胺或龙胆紫代替做平行)(3)盐酸的作用 盐酸能改变细胞膜的通透性，加速染色剂的跨膜运输； 盐酸使染色体中的DNA与蛋白质分离，便于DNA与染色剂的结合。 注意事项 1.材料的选择 选用的实验材料既要容易获得，又要便于观察；

2、 常用的观察材料由人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶表皮细胞(为避免原有颜色的干扰，不可使用紫色表皮细胞) 2.取材要点 取口腔上皮细胞之前，应先漱口，以避免装片中出现太多的杂质； 取洋葱表皮细胞时，尽量避免材料上带有叶肉组织细胞。 3.冲洗载玻片时水的流速要尽量慢，切忌直接用水龙头冲洗。 4.安全要点 用酒精灯烘烤载玻片时，不要只集中于材料处，而应将载玻片在火焰上来回移动，使载玻片均匀受热，以免破裂； 烘烤后的载玻片不要马上放入盛有稀盐酸的烧杯中，最好先自然冷却1分钟。 5.换用高倍镜观察材料时，只能用细准焦螺旋进行调焦，切不可动粗准焦螺旋。 主要步骤(以观察口腔上皮细胞为例) 1.取材 滴： 在

3、洁净的载玻片上滴一滴质量分数为0.9%的NaCl溶液； 刮： 用消毒牙签在口腔内侧壁上轻轻地刮几下； 涂： 将牙签上的碎屑涂抹在载玻片的生理盐水中； 烘： 将涂有口腔上皮细胞的载玻片在酒精灯的火焰上烘干。 2.水解 解： 将烘干的载玻片放入装有30ml质量分数为8%的盐酸的小烧杯中，进行材料的水解； 保： 将小烧杯放入装有30温水的大烧杯中保温5分钟。 3.冲洗涂片 冲： 用缓缓的蒸馏水冲洗载玻片10秒钟； 吸： 用吸水纸吸去载玻片上的水分。 4.染色 染：用2滴吡罗红甲基绿混合染色剂滴在载玻片上，染色5分钟； 吸： 吸去多余染色剂； 盖： 盖上盖玻片。 5.观察 低： 在低倍物镜下，寻找染色

4、均匀，色泽浅的区域，移至视野中央，将物像调节清晰； 高： 转到高倍物镜，调节细准焦螺旋，观察细胞核和细胞质的染色情况。2%甲基绿水溶液的配制甲基绿（methyl green） 蒸馏水加至 50mlc 用三氯甲烷抽提， 甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一 种化合物。由于甲基化作用，甲基绿就比甲基绿后，所引进的甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失。另一方面， 在甲基化过程中，还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，因此，也有人认为甲中，常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是，也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物，甲基绿在储存过程中，会不断产生

5、甲基紫。因此，在配制试剂时，必须 先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取 2%甲基绿水溶 液 20ml 倾入洁净分液漏斗，加入三氯甲烷 20ml 充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液 漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反复更换三氯甲烷，直到三氯甲烷无紫红色为止，即可得到得纯的甲基绿溶液。英文名称：Methyl Green 分子式：C27H35Cl4N3Zn 分子量：608.78 IUPAC 名称： 4-(4-(dimethylamino)phenyl)(4-(dimethyliminio)cyclohexa-2,5-dien

6、y lidene)methyl)-N-ethyl-N,N-dimethylbenzenaminium dichloride compound with zinc(II) chloride 甲基绿是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末。溶于水，显蓝绿色。 稍溶于乙醇，不溶于戊醇。 盐酸中显红黄色，在氢氧化钠中无色。试剂溶液在可见光区有吸收峰 (max=633.8nm)。 与 ReO4-、HgCl42-、BiI4-、AuCl4-和 GaCl4-等形成离子缔合物。 用于光度法测定 Hg2+、ReO4-等，定性检出铁氰化物，酸碱指示剂和细 胞染色剂。甲基绿为碱性染料，它易与聚合程度高的 DNA 结合呈

7、现绿色。 又称双绿 SF 双绿 SF。绿色晶体，具金黄色光泽，或淡绿色粉末。溶于水，呈蓝 绿色。微溶于乙醇，不溶于乙醚。 由氯甲烷与甲基紫(C.I.碱性紫 1)反应制得。 商品通常为锌复盐 C26H33N3Cl2ZnCl2(称 C.I.碱性蓝 20)。 用于细菌染色(新鲜标本细胞核染色)甲基绿-盐酸混合物用于检定精子、 淋球菌和肥大细胞染色。 甲基绿可用于鉴定 DNA。DNA 遇甲基绿（常温）会被染成蓝绿色。 甲基绿派洛宁 （methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的 DNA、RNA 结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中 DNA 选择

8、性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的 RNA 选择性结 合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核 酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的 DNA 结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的 RNA 结合呈现红色（但解聚的 DNA 也能和派洛宁结合呈现红色）。即 RNA 对派洛宁亲和力大，被染成红色， 而 DNA 对甲基绿亲和力大，被染成绿色。使用配制方法 关于吡罗红和甲基绿分装粉的使用方法 试剂及配制方法（ 1） 试剂 ） 质量分数为 0.9%的 NaCl 溶液，质量分数为 8%的盐酸，乙酸钠，乙酸， 蒸馏水，吡罗红甲基绿混装粉。如果化

9、学试剂商店没有吡罗红甲基绿混装粉， 可以分别购买甲基绿和吡罗红 G，然后按 A 液的第二种方法配制（见下文）。（ 2） 染色剂的配制 ） 染色剂 A 液的两种配制方法 第一种方法：取吡罗红甲基绿粉 1 g，加入到 100 mL 蒸馏水中溶解，然 后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。 第二种方法：取甲基绿 2 g 溶于 98 mL 蒸馏水中，取吡罗红 G 5 g 溶于 95 mL 蒸馏水中。取 6 mL 甲基绿溶液和 2 mL 吡罗红溶液加入到 16 mL 蒸馏 水中，即为 A 液，放入棕色瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红 G， 请不要错买吡罗红 B。） 染色剂 B 液的配制方法 B 液是一种缓冲液， 由乙酸钠和乙酸混合而成。 先取乙酸钠 16.4 g，用蒸馏水溶解至 1 000 mL 备用；再取乙酸 12 mL，用蒸 馏水稀释至 1 000 mL 备用。取配好的乙酸钠溶液 30 mL 和稀释的乙酸 20 mL， 加蒸馏水 50 mL，配成 pH 为 4.8 的 B 液（缓冲液）。 染色剂的配制 染色剂是由 A 液、B 液混合配制而成的。取 A 液 20 mL 和 B 液 80 mL 混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是 该试剂应现配现用。