24食品中那非类物质的测定.doc

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1、附件食品中那非类物质的测定（BJS 201805）1 范围本标准规定了食品（含保健食品）基质中90种那非类物质的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。标准中方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的定性和定量测定。标准中方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的筛查和定性确证。方法一 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法2原理

2、试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪测定，外标法定量。3试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：质谱级。3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。3.1.3 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。3.1.4 盐酸（HCl）：分析纯。3.2 试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。3.2.2 盐酸甲醇溶液（1+99）：取盐酸1mL用甲醇稀释至100mL。3.2.3 甲醇水溶液（1+1）：将甲醇与水等体积混合。3.3 标准品西地那非等90种物质标准品的中文

3、名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度98%。3.4 标准溶液配制3.4.1标准储备液（200 g/mL）：分别精密称取Lodenafil carbonate（46罗地那非碳酸酯）、Sildenafil dimer impurity（63西地那非二聚体杂质）、Vardenafil dimer（69伐地那非二聚体）标准品（3.3）各10mg，用盐酸甲醇溶液（1+99）溶解并稀释至50mL，摇匀；分别精密称取其余87种标准品（3.3）各10 mg，用甲醇溶解并稀释至50mL，摇匀，制成浓度为200 g/mL标准储备液。-20 避光贮存，有效期3个月。3.4.2 混合

4、标准中间工作溶液（1 g/mL）：分别准确吸取标准储备液（200 g/mL）（3.4.1）各0.1 mL， 用甲醇稀释至20mL，摇匀，制成1 g/mL的混合标准工作溶液。临用新制。根据化合物保留时间适当分组。3.4.3 混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间工作液（1 g/mL）（3.4.2）适量，用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）稀释，摇匀，作为系列混合标准工作溶液，浓度依次为各化合物2 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。或根据需要采用空白基质提取液（5.1.4），配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。

5、4 仪器和设备4.1高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源。4.2天平：感量分别为0.01 mg和0.1 mg。4.3微孔滤膜：0.22m，有机相型。4.4 离心机：转速4 000 r/min。4.5 超声波清洗器。5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1 固态或半固态试样取固态试样（蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、咖啡及含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊等剂型）适量混匀，研细，或取半固态试样（果冻）适量混匀，精密称取1g（精确至0.001 g）置于50 mL容量瓶中，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，转移至50 mL离心管中，4

6、000 r/min离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤（4.3），取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。5.1.2 液态试样取试样（饮料、酒）适量摇匀，准确吸取1mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，经微孔滤膜（4.3）过滤，取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。5.1.3 油脂基质（软胶囊）试样取试样（软胶囊）适量混匀，精密称取1g（精确至0.001 g）置于50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯5mL，振摇，使其分散，加甲醇（3

7、.1.1）适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，转移至50 mL离心管中，4 000 r/min离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤（4.3），取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。5.1.4 空白基质提取液 称取空白试样适量，与试样同法处理，制得空白基质提取液。5.1.5 空白溶液不加试样，与试样同法处理，制得空白溶液。5.2仪器参考条件5.2.1色谱条件a）色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 （3.0150 mm， 1.8 m），或性能相当者。b）流动相：A为0.1%甲酸水溶液（3.2.1），

8、B为甲醇（3.1.1），梯度洗脱程序见表1。c）流速：400 L/min。d）柱温：35。e）进样量：5 L。表1 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相A/%流动相B/%0901015050163565192982229822.190102590105.2.2 质谱条件a） 离子源：电喷雾离子源（ESI源）。b） 检测方式：多反应离子监测（MRM）。c） 碰撞气为高纯氮气，干燥气、雾化气、鞘气等均为氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附

9、录B。5.3 定性测定按照超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，当试样中检出与某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在2.5%之内），并且试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比（k）的偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）k50%50%k20%20%k10%k10%允许的最大偏差（%） 20 25 30 505.4定量测定5.4.1标准曲线的制作将混合标准工作溶液（3.4.3）分别按仪器参考条件（5.2）进

10、行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4.2试样溶液的测定将试样溶液（5.1.1-5.1.3）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到样品溶液中对应组分的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。对照品色谱图参见附录D。5.4.3空白溶液的测定空白溶液（5.1.5） 同试样溶液测定步骤操作。6 结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：（1）式中：X 试样中各待测物的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；c 从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓

11、度，单位为微克每升（g/L）；V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样溶液所代表的质量，单位为克（g或L）；f 稀释倍数。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8 其他当称样量为1 g（精确至0.001g）或1mL，定容体积为50mL时，本方法中90种那非类物质的检出限均为为0.051mg/kg或0.050.25 mg /L，定量限为0.12.5mg/kg或0.10. 5mg /L。详见附录C表C.1。空白试验应无干扰。方法二 超高效液相色谱-串联高分辨质

12、谱法2 原理试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供高效液相色谱-串联高分辨质谱测定，比较供试品与标准品的保留时间、一级质谱图和二级质谱图进行筛查和定性确证。3 试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1乙腈（C2H3N）：质谱级。3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。3.1.3 甲醇（CH3OH）：分析纯。3.1.4 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。3.1.5 盐酸（HCl）：分析纯。3.2试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。3.3标准品同方法一3.3标准品项下。3.4 标准溶液配制3.4.1标准

13、储备液（200 g/mL）：同方法一3.4.1标准储备液项下。3.4.2 混合标准工作溶液（1 g/mL）：同方法一3.4.2混合标准中间工作溶液项下。或依仪器响应情况配制至适当浓度。根据化合物保留时间和仪器扫描速度适当分组。4仪器和设备4.1高效液相色谱-串联高分辨质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源。4.2天平：感量分别为0.1 mg和1 mg。4.3滤膜：0.22m，有机相型。4.4 超声波发生器。5分析步骤5.1试样制备5.1.1 试样处理同方法一试样制备5.1.15.1.3项下，根据实际浓度适当稀释，备用。5.1.2 空白溶液制备同方法一空白溶液制备5.1.5项下。5.2 仪器参考条件

14、5.2.1 色谱条件a）色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18 （3.075 mm， 2.7m），或性能相当者。b）流动相：A为0.1%甲酸水溶液（3.2.1），B为乙腈（3.1.1），梯度洗脱程序见表3。c）流速：0.4mL/min。d）柱温：30。e）进样量：1L。表3 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相A/%流动相B/%0955152981729817.5955209555.2.2 质谱条件a）离子源：电喷雾离子源（ESI源）。b）干燥气、雾化气、鞘气、碰撞气等均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘

15、气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，母离子及碎片离子等参考信息详见附录E表E.1。6定性判定按照超高效人液相色谱-串联高分辨质谱条件测定试样（5.1.1）和混合标准工作溶液（3.4.2），记录试样和混合标准工作溶液中各化合物的色谱峰保留时间及多级质谱图，当试样中检出与某标准品色谱峰（或由标准品建立的谱库）保留时间一致的色谱峰，并且与标准品母离子精确分子量误差不超过百万分之五，主要碎片离子精确分子量误差不超过百万分之十，即可以确定试样中检出相应化合物。7 检测方法的灵敏度和专属性7.1 灵敏度当取样量为1 g或1 mL，定容体积为50 mL时，本方法中90种化

16、合物的检出限为0.170mg/kg或0.150mg/L，详见附录F表F.1。7.2 专属性取空白溶液（5.1.2）进样测定，应无干扰。取混合标准工作溶液（3.4.2）进样测定，各化合物之间应无互相干扰，同分异构体应可通过保留时间或二级质谱图进行区分。附录A西地那非等90种化合物相关信息表A.1 90种化合物英文名称、中文名称、分子式、CAS号、相对分子质量序号英文名中文名分子式CAS号分子量1Sildenafil西地那非C22H30N6O4S139755-83-2474.62Tadalafil他达拉非C22H19N3O4171596-29-5389.43Imidazosagatriazinon

17、e脱硫伐地那非C17H20N4O2139756-21-1312.44Gendenafil庆地那非C19H22N4O3147676-66-2354.45Acetil acid那非乙酰酸C18H20N4O4147676-78-6356.46Xanthoanthrafil苯酰胺那非C19H23N3O61020251-53-9389.47Aminotadalafil氨基他达拉非C21H18N4O4385769-84-6390.48Chloropretadalafil他达拉非甲基氯化物C22H19ClN2O5171489-59-1426.89Piperiacetildenafil苯噻啶红地那非C24H3

18、1N5O3147676-50-4437.510Noracetildenafil那红地那非C24H32N6O3949091-38-7452.511Carbodenafil卡巴地那非C24H32N6O3944241-52-5452.512Pseudovardenafil伪伐地那非C22H29N5O4S224788-34-5459.613Norneosildenafil那莫西地那非C22H29N5O4S371959-09-0459.614N-DesethylvardenafilN-去乙基伐地那非C21H28N6O4S448184-46-1460.615N-DesmethylsildenafilN-去

19、甲基西地那非C21H28N6O4S139755-82-1460.616Acetildenafil红地那非C25H34N6O3831217-01-7466.617Hydroxyacetildenafil羟基红地那非C25H34N6O4147676-56-0482.618Avanafil阿伐那非C23H26ClN7O3330784-47-9484.019Aildenafil艾地那非C23H32N6O4S496835-35-9488.620Homosildenafil豪莫西地那非C23H32N6O4S642928-07-2488.621Vardenafil伐地那非C23H32N6O4S224785-

20、90-4488.622Thiosildenafil硫代西地那非C22H30N6O3S2479073-79-5490.623Thiohomosildenafil硫代豪莫西地那非C23H32N6O3S2479073-80-8504.724Hydroxyvardenafil羟基伐地那非C23H32N6O5S224785-98-2504.625Hydroxyhomosildenafil羟基豪莫西地那非C23H32N6O5S139755-85-4504.626Udenafil乌地那非C25H36N6O4S268203-93-6516.727Hydroxythiohomosildenafil羟基硫代豪莫西

21、地那非C23H32N6O4S2479073-82-0520.728Norneovardenafil那莫伐地那非C18H20N4O4358390-39-3356.429Nitrodenafil硝地那非C17H19N5O4147676-99-1357.430Nortadalafil去甲基他达拉非C21H17N3O4171596-36-4375.431Chlorodenafil氯地那非C19H21ClN4O31058653-74-9388.832Hydroxychlorodenafil羟基氯地那非C19H23ClN4O31391054-00-4390.933N-ButyltadalafilN-丁基他

22、达拉非C25H25N3O4171596-31-9431.534Desmethylcarbodenafil去甲基卡巴地那非C23H30N6O3147676-79-7438.535Descarbonsildenafil去碳西地那非C21H30N6O4S1393816-99-3462.636Dimethylacetildenafil二甲基红地那非C25H34N6O31290041-88-1466.637Dithio-desmethylcarbodenafil二硫代去甲基卡巴地那非C23H30N6OS21333233-46-7470.738Oxohongdenafil酮红地那非C25H32N6O414

23、46144-70-2480.639N-OctylnortadalafilN-辛基去甲他达拉非C29H33N3O41173706-35-8487.640Dioxohongdenafil双酮红地那非C25H30N6O51609405-33-5494.541Hydroxythiovardenafil羟基硫代伐地那非C23H32N6O4S2912576-30-8520.742Cyclopentynafil环戊那非C26H36N6O4S1173706-34-7528.743Propoxyphenyl thiohydroxyhomosildenafil丙氧苯基硫代羟基豪莫西地那非C24H34N6O4S24

24、79073-90-0534.744Benzylsildenafil苄西地那非C28H34N6O4S1446089-82-2550.745Cinnamyldenafil桂地那非C32H38N6O31446089-83-3554.746Lodenafil carbonate罗地那非碳酸酯C47H62N12O11S2398507-55-61035.247Propoxyphenylsildenafil丙氧苯基西地那非C23H32N6O4S877777-10-1488.648Depiperazinothiosildenafil脱哌嗪基硫代西地那非C17H20N4O4S21353018-10-6408.5

25、49Acetaminotadalafil乙酰胺基他达拉非C23H20N4O51446144-71-3432.4502-Hydroxypropylnortadalafil2-羟丙基去甲他达拉非C24H23N3O51353020-85-5433.551Acetylvardenafil乙酰伐地那非C25H34N6O31261351-28-3466.652Propoxyphenyl hydroxyhomosildenafil丙氧苯基羟基豪莫西地那非C24H34N6O5S139755-87-6518.653Propoxyphenyl thioaildenafil丙氧苯基硫代艾地那非C24H34N6O3S

26、2856190-49-3518.754Yohimbine育亨宾C21H26N2O3146-48-5354.455Dapoxetine达泊西汀C21H23NO119356-77-3305.456N-DesethylacetildenafilN-去乙基红地那非C23H30N6O3147676-55-9438.557Desmethylthiosildenafil去甲基硫代西地那非C21H28N6O3S2479073-86-4476.658N-Boc-N-desethyl acetildenafilN-叔丁氧羰基-N-去乙基红地那非C28H38N6O51246820-46-1538.659N-Ethy

27、ltadalafilN-乙基他达拉非C23H21N3O41609405-34-6403.460O-DesethylsildenafilO-去乙基西地那非C20H26N6O4S139755-91-2446.561Pyrazole N-desmethylsildenafil吡唑N-去甲基西地那非C21H28N6O4S139755-95-6460.662Isobutylsildenafil异丁基西地那非C23H32N6O4S1391053-95-4488.663Sildenafil dimer impurity西地那非二聚体杂质C38H46N10O8S21346602-67-2835.064Vard

28、enafil oxopiperazine伐地那非哌嗪酮C21H26N6O5S448184-58-5474.565Sildenafil N-oxide西地那非N-氧化物C22H30N6O5S1094598-75-0490.666Vardenafil N-oxide伐地那非N-氧化物C23H32N6O5S448184-48-3504.6672-Hydroxyethylnortadalafil2-羟乙基去甲他达拉非C23H21N3O5385769-94-8419.468Vardenafil acetyl analogue伐地那非乙酰基类似物C24H31N5O3/437.569Vardenafil d

29、imer伐地那非二聚体C38H46N10O8S21255919-03-9835.070Mirodenafil米罗那非C26H37N5O5S862189-95-5531.771Mutaprodenafil亚硝地那非C27H35N9O5S21387577-30-1629.872Thioquinapiperfil硫喹哌非C24H28N6OS220060-39-9448.673Aminosildenafil氨基西地那非C18H23N5O4S319491-68-4405.574Desethylcarbodenafil去乙基卡巴地那非C22H28N6O31027192-92-2424.575Didesca

30、rbonsildenafil双去碳西地那非C20H28N6O4S466684-88-8448.576N-PhenylpropenyltadalafilN-苯丙烯基他达拉非C30H24N4O42064212-00-4504.577N-Desethyl-N-methylvardenafilN-去乙基-N-甲基伐地那非C22H30N6O4S224785-87-9474.678Thioaildenafil硫代艾地那非C23H32N6O3S2856190-47-1504.779Dichlorodenafil双氯地那非C19H20Cl2N4O21446089-84-4407.380Piperazonifi

31、l哌唑那非C25H34N6O41335201-04-1482.681Propoxyphenyl thiosildenafil丙氧苯基硫代西地那非C23H32N6O3S2479073-87-5504.782Propoxyphenyl thiohomosildenafil丙氧苯基硫代豪莫西地那非C24H34N6O3S2479073-88-6518.783Dithiodesethyl carbodenafil二硫代去乙基卡巴地那非C22H28N6OS21610830-81-3456.684Hydroxythioacetildenafil羟基硫代红地那非C25H34N6O3S1159977-47-54

32、98.785Tadalafil dichloro impurity他达拉非二氯代杂质C22H18Cl2N2O51598416-08-0461.386Sildenafil impurity 12西地那非杂质12C25H34N6OS2/498.787Demethylpiperaziny sildenafil sulfonic acid去甲基哌嗪基西地那非磺酸C17H20N4O5S1357931-55-5392.188Propoxyphenyl aildenafil丙氧苯基艾地那非C24H34N6O4S1391053-82-9502.689Sildenafil impurity 14西地那非杂质14

33、C24H32N6OS22146091-79-2484.790Propoxyphenylisobutyl aildenafil丙氧苯基异丁基艾地那非C25H36N6O4S1621873-33-3516.7注：68 Vardenafil acetyl analogue伐地那非乙酰基类似物C24H31N5O386 Sildenafil impurity 12西地那非杂质12C25H34N6OS2附录B超高效液相-三重四极杆串联质谱参考条件质谱参考条件a 离子源：电喷雾离子源（ESI）；b 检测方式：多反应监测 （MRM）；c 扫描方式：正、负离子模式；d 毛细管电压：3.5kV； e 干燥气温度：3

34、25；f 干燥气流量：7L/min；g 雾化气压力：40psi；h 鞘气温度：350 ；鞘气流量：11L/min；i 喷嘴电压：正离子： 0V；负离子：1000V；j 其他质谱参数见表B.1。表B.1 化合物定性、定量离子和质谱分析参数序号化合物母离子（m/z）子离子（m/z）碎裂电压（V）碰撞能量（V）离子化模式保留时间（min）1Sildenafil475.2283.117046+6.42475.2100.1*17030+2Tadalafil390.2268*12010+11.47390.213512026+3Imidazosagatriazinone313.2285. 1*14526+1

35、9.98313.225614534+4Gendenafil355.2327.1*16026+17.81355.228516034+5Acetil acid357.2329.1*17026+15.38357.2285.117034+6Xanthoanthrafil390.2151*10510+9.39390.210710574+7Aminotadalafil391.1269*13010+9.05391.120413066+8Chloropretadalafil427.127414534+15.57427.1135*14518+9Piperiacetildenafil438.2297.116542

36、+6.01438.298.1*16534+10Noracetildenafil453.316621058+5.78453.397.1*21034+11Carbodenafil453.3339.1*16026+4.80453.3311.116038+12Pseudovardenafil460.2312.121542+19.13460.2151*21550+13Norneosildenafil460.2299.121042+19.80460.2282.9*21042+14N-Desethylvardenafil461.2312.119538+5.85461.2151*19558+15N-Desme

37、thylsildenafil461.2311.118034+6.45461.2283*18042+16Acetildenafil467.3127.119034+5.82467.3111.1*19034+17Hydroxyacetildenafil483.3143.120538+5.58483.3127.1*20534+18Avanafil484.2375.1*17530+5.66484.215517546+19Aildenafil489.2113.1*19034+7.06489.299.119038+20Homosildenafil489.2113.1*18030+6.48489.272.21

38、8050+21Vardenafil489.2312.120046+6.24489.2151*20054+22Thiosildenafil491.229916542+14.26491.2100.1*16530+23Thiohomosildenafil505.229917046+14.32505.2113.1*17034+24Hydroxyvardenafil505.2312.119046+6.48505.2151*19054+25Hydroxyhomosildenafil505.2129.119042+6.85505.299.1*19042+26Udenafil517.3283*20050+7.

39、89517.3112.120038+27Hydroxythiohomosildenafil521.2129.119034+14.12521.299.1*19038+28Norneovardenafil357.2329.117526+12.73357.2151*17534+29Nitrodenafil358.2330.1*16026+19.45358.2284.116034+30Nortadalafil376.125410510+9.56376.1204*10570+31Chlorodenafil389.1361.1*17030+18.89389.128517038+32Hydroxychlor

40、odenafil391.2313.1*18038+18.37391.2285.118034+33N-Butyltadalafil432.2310.1*13014+19.36432.213513030+34Desmethylcarbodenafil439.2339.1*16522+4.67439.2311.116534+35Descarbonsildenafil463.2311.116534+5.65463.2283.1*16542+36Dimethylacetildenafil467.316619558+6.93467.3127.1*19534+37Dithio-desmethylcarbodenafil471.2371.1*16522+15.62471.2343.116538+38Oxohongdenafil481.3297.116550+12.09481.3410.2*16534+39N-Octylnortadalafil488.316913550+20.71488.3366.2*13514+40Dioxohongdenafil495.2311.119046+11.03495.2127.1*19042+41Hydroxythiovardenafil521.2167*21570+11.27521.299.121538+42Cyclopen