碱裂解法提取质粒DNA.docx

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1、碱裂解法提取质粒DNA溶液 I： 50 mM Glu / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA （pH 8.0）；重悬菌体，供应缓冲环境。 （pH很重要）。葡萄糖：最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加粘稠度，削减 摇摆时对DNA的机械剪切力。如缺了葡萄糖对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以 说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA：它是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制 DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA,就是要把Eco细胞中 的全部二价金属离子都螯合掉。假设不加EDTA,

2、只要是在短时间里完成质粒抽提，也不怕DNA 会快速被降解，由于最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。假如哪天你手上正好缺了溶液I,只要用等体积的水，或LB培育基来悬浮菌体就可以了。留 意菌体肯定要悬浮匀称，不能有结块。溶液H： 0.2MNaOH/l%SDS；裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放质粒。NaOH：用新奇的NaOH,是为了保证NaOH没有汲取空气中的CO2而减弱了碱性。裂解细 胞的主要是碱，而不是SDS,所以才叫碱法抽提。NaOH是最正确的溶解细胞的试剂，不管是大肠 杆菌还是哺乳动物细胞，遇到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双 层膜）结构向micel

3、le （微囊）结构的相变化所导致。用了不新奇的NaOH,即便有SDS也无法有 效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。只用SDS也能抽提得到少量质粒，由于SDS 也是弱碱。加SDS是为下一步操作做铺垫。留意：一，时间不能过长,在这样的碱性条件下基因组DNA片断会渐渐断裂；二，必需温 顺混合,不然基因组DNA也会断裂。溶液III： 3M KAc / 2 M HAco加入后就会有大量的沉淀消失，与SDS的加入有关系。 假如在溶液n中不加SDS时也会有很少量的沉淀，明显是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。SDS 在高盐浓度（如NaCl）下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS的沉淀。KAc,钾

4、离子置换了 SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐，使得沉淀更完全。 （注：十二烷基硫酸钠遇到K+后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）。SDS 特地喜爱和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀 将绝大局部蛋白质（不是全部）沉淀了，E.coli的基因组DNA也一起被共沉淀了。SDS并不与 DNA分子结合，但是基因组DNA太长了，简单被PDS给共沉淀了。HAc：是为了中和NaOH,防止长时间的碱性条件打断DNA。基因组DNA 一旦发生断裂， 只要是50100 kb大小的片断，就没有方法再被PDS共沉淀

5、了。所以碱处理的时间要短，且不得激烈振荡,不然最终得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观看到一 条浓浓的总DNA条带。许多人误认为是溶液ni加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀是不 对的，由于变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH原来是为了溶解 细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀能得到质量稳定的质粒DNA,不 然时间一长就会由于混入的DNase而发生降解。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应当用酚来最大程度将蛋白质抽提掉, 但

6、是水饱和酚的比重略比水重，遇到高浓度的盐溶液（比方4M的异硫氟酸肌；），离心后酚相见跑 到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，便利 水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，单独用酚抽提后有大量的酚溶解到水相中，而 酚会抑制许多酶反响（比方限制性酶切反响），应此单独用酚抽提后肯定要用氯仿抽提一次将水相 中的酚去除。而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚那么少得多，微量的酚在乙醇沉淀时 就会被除洁净而不必担忧酶切等反响不能正常进行。异戊醇：主要是让离心后上下层的界面更加清楚，便利水相的回收。回收后的水相含有足够 多的盐，因此只要加入2倍体积的乙

7、醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。 这时假如放到一20,时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于一般的DNA酒精沉淀回 收。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就简单形成氢键而发生沉淀。如感觉 发生了盐的沉淀，就用70%的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打 碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase （50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不 然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数状况下能看到 三条带，千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含 线性DNA （用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三 条带的位置不一样）。其实这三条带分别是超螺旋（最快）、开环（中间）和复制中间体（最慢： 即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。假如你不留神在溶液II加入后过度振荡，会有第四条 带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20J00kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。有时候抽 提到的质粒会有710条带，这是由于特别的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈 数不同）所致。