黑曲霉发酵生产纤维素酶实验1.docx

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1、nn曲霉发酵生产纤维素酶试验一、试验目的1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、把握液体发酵和固体发酵工艺3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、试验原理纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有宽阔的应用前景。高 产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中 8 -葡萄糖甘酶活力高，能避开酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且平安无毒， 故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有 纤维素物质作诱导剂。以竣甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解 液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力凹凸。还原糖与DNS反响

2、形 成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。三、材料与试剂配制1、生产菌种：黑曲霉2、斜面（活化）培育基：酵母膏0.4%,蛋白豚0.6肌可溶性淀粉1%, 葡萄糖0.9%,马玲薯浸出液7%,琼脂2%,陈海水（或人工海水）配制，。3 人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4 7H2 0 = 7. 0 g/L ;NH4N03 = 1 g/L ;KC1 =0. 7 g/ L ; NaH2P04 = 2. 0 g/ L ; Na2HP04 =3.0 g/ L , pH7. 4。4、微量元素液： FeS04 7H2O 5. Omg/L , MnS04 H20 1. 6mg/L , ZnSO. 7H2

3、0 1.4mg/L, CoCl2 2. Omg/L,加蒸偏水 200nli 使之溶解。5、液体发酵产酶培育基：款皮作碳源3 g,氯化钱或硫酸钱作无机氮 源1 g,蛋白陈0.05g作有机氮源，人工海水100 ml （含1%微量元素液），自 然pH值。6、固体发酵产酶培育基：秋皮：稻草粉=2： 1作碳源5 g,人工海水12 ml (含1%微量元素液，1%氯化镂或硫酸镂，0.05%蛋白月东)，自然pH值。7、6%DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500nli水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3, 5-二硝基水杨酸6g, 20. 8gNaOH, 5g苯酚，5g无水亚硫酸钠, 加热搅拌溶解，冷却后定

4、容至1000mL储存在棕色瓶中放置一周后使用。(提前 配制)8、0. 1 mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液(pH 4.8)0.lmol/L柠檬酸钠溶液100mL:称2.941克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为294.12),约20L蒸储水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。(1) 0. lmol/L柠檬酸溶液100mL:称2. 101克柠檬酸(柠檬酸的分子量为210. 14),约20L蒸储水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。(2) pH4. 8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液100mL:量取0. lmol/L柠檬酸钠溶液 54mL和0. lmol/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。9、1%CMC

5、-Na 溶液称取1. 0克竣甲基纤维素纳，用pH 4. 8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液加热溶解。10、Img. mL-1标准葡萄糖溶液lmg/mL葡萄糖溶液250mL:精确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。四、主要仪器恒温培育箱，摇床培育箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天公平。五、试验步骤1、培育基配制分别按上述方法配制液体发酵培育基和固体发酵培育基，121C灭菌20分钟。2、胞子悬液的制备将斜面培育基上的曲霉抱子用少量无菌人工海水洗下，采用玻璃珠在磁力搅 拌下搅拌1520分钟，充分打散抱子，稀释成5x107个/ml左右的抱子悬液。3、液体发酵产酶试验按6% (v/v )接种量

6、将浓度约为5义10 7个/ml的菌株胞子悬液接入已灭菌的液体发酵培育基（150 ml锥瓶装液100 ml）,于35, 180r/min条件下摇 床培育5天。发酵液4、5000 r/min离心15 min,上清液稀释5倍，测定发 酵液中的酶活力。4、体发酵产酶试验100 ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培育基，按1:3（v/w）接种量将浓度 约为5义10 7个的菌株抱子悬液，于35c恒温培育箱中培育，接种48小时后隔 天翻曲一次，第四或第五天补充无菌水保持基质水分。培育5天后，取发酵成熟 曲1g,加蒸储水10ml,搅拌匀称，30,浸提lh,双层纱布过滤，滤液经4, 5000rmp离心15min

7、,上清为粗酶液。测定时适当分级稀释，使OD54O在0. 21. 0范 围。5、酶活力测定及酶活力定义（1）葡萄糖标准曲线绘制精确称取无水葡萄糖250mg，溶解定容到250mlo分别吸取此液1.0, 2. 0, 3.0, 4. 0, 5.0 ml至5个25ml的比色管中,用蒸储水定容到25nli （即 加水 24, 23, 22, 21, 20ml）再分别吸取上溶液各2. 5ml于比色管中（糖液分别含糖量为 0. 1,0. 2,0. 3, 0. 4, 0. 5mg）,各加 2. 5mlDNS 试剂,煮沸 5min。（比照管 2. 5ml 水 代替糖液，冷却，测定0D54。表1葡萄糖标准曲线绘制加

8、样表管号123456蒸储水（mL）2.5一一标准葡萄糖2.52.52.52.52.5(mL)DNS (mL)2.52.52.52.52.52.5含糖量（mg）00.10.20.30.40.5OD540以糖含量为横坐标，Am为纵坐标，（或反过来）绘制标准曲线。（1）内切葡聚糖酶（CMCase）酶活：取适当稀释的酶液0. 5 ml,加入2. 0 ml 1% (W/V)的CMC-Na溶液(溶于0. Imol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液,pH 4. 8), 60反响30 min,加入2. 5 ml DNS终止反响，沸水浴显色5 min,测定OD54O。 以灭活酶液作比照。比照组：取适当稀释的酶液0.5

9、ml,加入2. 5 ml DNS 60反响30 min, 加入2.0 ml 1% (W/V)的CMC-Na溶液(溶于0. 1 mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲 液，pH 4. 8),沸水浴显色5 min,测定OD540o(2)滤纸酶(FPA)酶活：取50 mg (IX 6 cm)新华滤纸，加入酶液0.5 ml, 再加入pH 4. 8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2. 0 ml, 60反响30min,其它同前。比照组：取适当稀释的酶液0.5 ml, 60反响30min,加入2. 5 ml DNS、2.0 mlpH 4. 8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液、50 mg (IX 6 cm)新华滤纸，沸水浴5min,

10、 测定0D540o酶活力定义：在上述反响条件下，每分钟催化底物水解生成1 Mmol葡萄糖 所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活力二mz、式中卜为由标准曲线查得或回归方程算得的还30x0.5x 180原糖含量，mgo六、数据处理.试验纪录(1)菌体每天的生长状况：第一天黑曲霉没多大的变化，其次天时黑曲霉 已扩散快速，开头变白，第三天培育基上已经有一层白色的菌落，第四天菌落由 白色已经渐渐的变成鲜黄色，第五天培育基上的菌落已经变成了黑色厚绒状。(2)酶活的测定的试验数据纪录：CMCase 酶活：液体发酵产酶的测量数据如表1：平均比照组(5400. 0000. 0000. 0000. 000试验组

11、0D5400. 2210. 2210. 2210. 221固体发酵产酶的测量数据如表2：*-平均比照组0D5400. 0000. 0000. 0000. 000试验组0D5400. 4010. 4010. 4000. 401FPA酶活:vi液体发酵产酶的测量数据如表3：.平均比照组OD54o0. 0000. 0000. 0000. 000试验组od54O0. 2360. 2350. 2360. 2362固体发酵产酶的测量数据如表4：.平均比照组OD5400. 0000. 0000. 0000. 000试验组OD54O0. 5480. 5480. 5480. 548表5葡萄糖标准曲线绘制加样表管

12、号123456蒸储水(mL)2. 5标准葡萄糖(mL)2. 52. 52. 52. 52.5DNS (mL)2.52. 52.52.52. 52.5含糖量(mg)00. 10.20.30.40. 5OD540 /测量次数0. 0000.0110. 1950. 3830. 5630. 8920. 0000.0110. 1940. 3830. 5630. 906*0. 0000.0110. 1950. 3830. 5640. 907平均0. 0000.0110. 1950. 3830. 5630. 902葡萄糖稀释两倍后的含糖量:试管号123456含糖量 (mg)00.050.10.150.20.

13、2500. 050. 10. 150.20.25含糖量(mg)酶活力二Ax5xl00030x0.5x180依据上表数据，以糖含量为横坐标，A54。为纵坐标可绘制以下标准曲线:标准曲线1. 0000. 9000. 8000. 7000. 600.5000. 4000. 3000. 2000. 1000. 0001 .酶活测定结果(1)内切葡聚糖酶(CMCase)酶活：液体发酵产酶的酶活力计算:且依据标准葡萄糖标准曲线及表1的数据可以得到，A=0. lOlmg 所以酶活力*器U黑=87(U/m】)固体发酵产酶的酶活力计算: 同理可得,A=0. 155mg船、工为Ax5xl000 0.155x5x1

14、000 Q 0rlem、所以,酶活力=2. 870 (U/g)30x0.05x18030x0.05x180(2)滤纸酶酶活测定的计算：液体发酵产酶的酶活力计算: 同理可得,A=0. llmg所以，酶活力二一X5X1000 R. 203(u/ml)30x0.5x180固体发酵产酶的酶活力计算：同理可得,A=0. 19mg所以，酶活力:一* 5x1000 =3. 518 (U/g)30x0.05x1802 .结果分析和争论由以上计算可得，本次试验测得的酶活力较低。而导致消失这样结果偏差的 缘由有一下几点：接种培育阶段：1 .在接种期间对于无菌环境的试验条件掌握得不好，使得培育基有少量杂菌污 染；.试验器材预备缺乏，药品称量过程不够严谨，不够精准2 .在固体培育菌种期间，没有每天去翻曲，导致最终菌种只在固体培育基表层生 长，使得黑曲霉生长受抑制，导致酶活性降低；酶活力测定阶段：1 .在进行液体、固体发酵产酶试验中，预备离心取上清液前，没有把装有待离心 液体的离心管放于冰箱内，且隔了一段时间才去离心。2 .离心状况不好，上清液中含有少量游离的沉淀物，影响后续酶活力的测定。附表：试验原始数据如下: