细胞生物学细胞生物学教案.docx

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1、细胞生物学教学方案第一章 序论第一节 细胞生物学的特点第二节 细胞学和细胞生物学开展简史的名言 一 细胞的发觉 二 细胞学说的建立 细胞学说的主要内容 ()的名言 二细胞学的经典时期 原生质和原生质体概念的提出 原生质()原生质体 () 细胞分裂的讨论 重要细胞器的发觉 三 细胞学的分支遗传学的开展() 精卵细胞染色体数只是体细胞染色体数的一半() 孟德尔定律的重新发觉(3)1905 发觉性别和染色体的关系 预见遗传单位有次序的排列在染色体上 () 染色体学说 染色体行为和遗传因子联络起来.() 连锁 基因图 细胞生理学 细胞化学四 细胞生物学的形成及开展 空间构造的发觉 六十年头 细胞生物学

2、 产生 七十年头 细胞生物学教学的开展 八十年头 分子细胞生物学的开展 九十年头 分子细胞生物学高科技手段的开展和运用 指纹 技术 杂交瘤技术的运用 第二章 细胞根本学问第一节 非细胞形态的生命体 朊病毒() 巴布亚新几内亚一土著 库鲁病 笑死症 羊脑 风牛病 类病毒 病毒第二节 原核细胞 支原体 衣原体 立克次氏体 放线菌细菌和蓝藻第三节 真核细胞根本学问概要 三大系统 动植物细胞的比较 第三章 细胞生物学讨论方法 自年荷兰学者列文虎克( )用单显微镜(单透镜)第一次看到酵母活细胞以来,人们始终在努力改革和开展视察手段，来讨论细胞较深层次的形态和构造。今日人们已经有了具有原子尺度高辨别本事的

3、扫描隧道显微镜。及此同时人们还创立了一系列对细胞组分和细胞生理活动进展详尽分析的方法和手段,它们提醒了各种细胞构造及生物大分子在细胞内的功能和作用。为了供给大量均一的细胞作为生物学的讨论材料,人们又开展了一系列细胞培育技术。这些培育技术已经给人类带来了极大的利益。可以认为，细胞形态构造的视察技术，细胞组分及功能的分析技术及细胞培育技术是细胞生物学赖以开展的三大技术手段。在这里我们只能对某些具有代表性的试验技术的根本原理和技术特点作一简洁的介绍。盼望学生通过本章的学习不但能理解试验技术本身，还可以理解到细胞生物学这一试验科学的开展是和试验技术的进步休戚相关的,因此开展和开发先进的试验技术也是细胞

4、生物学的一项重要内容。 第一节 细胞形态构造的视察方法一 固定法及活体视察法 固定法是以确定的化学物质的溶液(有时是气体)在尽可能保持细胞生活构造的状况下快速杀死组织块。这一过程称为固定()。然后制成薄切片,再染色()进展视察。这种方法比起视察活细胞有三个优点:第一,它能清晰地显现细胞的微小构造,如关于染色体,各种细胞器、细胞膜和细胞壁的微细构造都是靠这种方法说明的。第二,这种方法的制片一般均能保存很久,便于前后讨论各种现象之比较。第三,应用范围广,几乎可用于全部的组织细胞。 这种方法不仅在细胞学开展的历史上发挥过很大作用,而且在现代细胞学中也是重要讨论手段之一。例如用电子显微镜讨论细胞亚显微

5、构造时通常都运用固定法。固定法在细胞化学的讨论上也有广泛的应用。固定法的缺点是,在用固定剂()杀死细胞的同时,常常难免使细胞的某些生活构造发生确定的变形。因此这种方法不能完全照实地反映生活细胞的状况。在理论上往往是能保存细胞某种构造的固定剂,却不能使另一些构造保存下来。例如,适于视察染色体的固定剂,对于视察线粒体就不适宜。有人因为固定法的这种缺点而对它抱疑心主义的看法。这是过分偏激的观点。事实上只要选择适宜的固定剂,这种方法是能展示给我们细胞构造的许很多多细微环节的。当然,另一方面在应用此法时也不应当忘掉它的固有缺点。在讨论某种构造时,最好同时多用几种固定剂，比照分析所视察的现象，以免做出主观

6、的推断。活体视察法的优缺点及固定法正好相反。它的优点是可以照实地反映生活细胞的状况。但完全做到这一点也并不简洁，必需严格限制试验条件，最大限度地使所视察的细胞得到正常生活条件。活体视察的缺点是，显示细胞构造的精细程度较差。这和在活体状况下细胞内各种构造的折光率相近有关。相差显微镜的运用虽然在确定程度上可以克制这一缺点，但较之固定法在显示细胞构造的精细程度上仍大有逊色。 由于组织培育方法的进步，可以进展活体视察的细胞种类也大大增多。 固定法和活体视察法各有优缺点，不能互相代替。只有结合并用，取长补短，方有利于全面相识细胞生活的真相。 二 各种显微镜 视察细胞离不开显微镜（）。这正象视察天体要用望

7、远镜一样。常用的显微镜有一般光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等。 、一般光学显微镜（ ）的辨别本事各种显微镜识别微观物象的实力常用辨别力（ ）的概念来表示。辨别力是指可以区分相近两点的最小间隔 ，可以区分的两点间间隔 越小，表示显微镜的辨别力越高。辨别力亦称辨别本事。显微镜的辨别力是由物镜确定的。它和物镜的镜口率、照明光线的波长有干脆关系。辨别力可按下式计算： 辨别力照明光源的波长镜口率（数值孔径） 物镜及标本间的介质的折射率物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线及物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度（）。镜口角小于，故的最大值也小于。 从公式（）可

8、以看出，为进步辨别力，光源波长(越小越好，而物镜的镜口率越大越好。按可视光线的波长(（毫微米）为毫微米，物镜的最大镜口率为计算，微米。这就是说，相近两点的间隔 小于微米时，一般光学显微镜将不能辨别出这两点。因为可视光线的波长可小到毫微米。所以一般认为一般光镜的辨别本事的极限约为微米。 细胞中的构造如染色体、线粒体、中心体、核仁等大于微米，在光学显微镜中能视察到。这种构造称显微构造（ ）内质网的膜、核膜、微管、微丝等因小于微米，在一般光学显微镜下看不到，称为亚显微构造（ ）。 从公式()可以看出，要增大镜口率必需进步物镜及标本间介质的折射率。空气的折射率为，香柏油的折射率为。因为要增大镜口率必需

9、用油浸物镜。 、暗视野显微镜 暗视野显微镜( )是依据丁达尔()效应的原理设计的。若在暗室中穿入一细束光线,那么由侧面视察时,那些在一般照明的散射光下看不见的空气中的细小尘埃颗粒,可以看得很清晰。这种现象称丁达尔现象。暗视野显微镜是因为视野内不能干脆看到照明光线,只能看到被检物体散射或衍射的光线。故视野内呈黑暗状态。由于被检物体外表散射的光亮.才使我们可以在黑暗的视野中视察到被检物体的外形和运动。一般显微镜的最高辨别力如上所述为 微米,而暗视显微镜虽然对被检物体的微小构造辨别不清,但却可看到微米以上的微粒子的存在。这是一般光学显微镜所不具有的特性。暗视野显微镜及一般显微镜的构造差异,在于集光器

10、的特殊。一般显微镜换上暗视野集光器或用中心挡光法(用黑色厚纸或金属薄片制成圆形挡光片。放在一般集光器下面的滤光玻片上，拦住中央光束)。即可获得暗视野效果。用中心挡光法若想获得良好的暗视野效果，除了选择适当直径的中心挡光片外，还须考虑反射镜的角度，光源的强度等各种因素。常见的暗视野集光器是抛物面集光器（图）。它的集光镜是一个单透镜，四周成斜度较小的抛物线形式。由显微镜的反光镜反射出的光线，被集光镜的中部遮光板所阻挡，但侧面光线则自由进入遮光板旁和透镜边缘之间的缝隙。这些光线在聚光镜的抛物面的凹面上发生折射,结果光线集中到聚光镜的界面以外,处于视察标本的平面上。由于直线进展的光束被遮光板拦住不能进

11、入物镜,因此视野变暗。而折射光线集中到标本的物镜构造时被散射特别光亮,通过物镜到达视察者眼中,故视察细胞的某些构造(尤其是细胞质颗粒)是亮的(图)。 、相差显微镜 人们在显微镜下视察被检标本时,只能靠颜色(光波的波长)和亮度(光波的振幅)的差异看到被检物的构造。活细胞近于无色透亮,当光波通过它时颜色和亮度变更不大。因此在一般光学显微镜下细致视察活细胞的构造是很难的。 三十年头.提出相差显微镜( )的原理和设计,四十年头开场制造相差显微镜出售。由于有了相差显微镜,在确定程度上克制了上述困难可以干脆看到活细胞中的构造变更。相差是指同一光线经过折射率不同的介质,其相位发生的差异。那么什么是相位呢？相

12、位是在某一时间上光的波动所能到达的位置。当光波通过两种不同折射率的物质时(如由空气入水,或由空气入玻璃),其波长、振幅和相位皆有不同程度的变更。例如,使光分别通过公分厚的水和玻璃时,由于水和玻璃的折射率不同,通过它们的光波的相位产生确定差异（通过玻璃的光波的相位落后)。这个相位差异称相差(图)。相差确定于光波所通过的介质的折射率之差及厚度,等于折射率及厚度的乘积之差。介质越厚或折射率越大,光波减速也越大。 光线的相差用肉眼辨别不出,只有利用衍射和干预现象,把相差变为振幅差,即明暗之差,肉眼才能识别。光波通过小颗粒(物体)后产生直射光和衍射光。后者的振幅较小,相位延后(图)。当在光学系统中,这种

13、直射光和衍射光相遇时,依据它们相位的异同,其振幅发生减小或加大的变更,使光线变暗或变亮,这种现象称为干预。相差显微镜的工作原理如图和图所示。光线通过聚光镜下的环状光阑在物镜的焦点面聚光。载片上的物体受来自环状光阑的光线照耀,直射光在处成像，而散发的衍射光一部分也由于物镜透镜的作用在成像。这时视察者看到的是直射光和衍射光在处干预形成的像。但假如运用的是一般物镜，衍射光的相位落后波长，并且比直射光的成像弱，因此干预合成的光及背景光线的振幅差异很小。相差显微镜的物镜中安装有相板。相板有推延直射光或衍射光的相位和汲取光量，以调整直射光或衍射光的亮度的作用。利用相差物镜的相板，把直射光推延波长，使直射光

14、和衍射光维持同一相位（图、）两者的光波由于干预现象，其振幅为二者之和。因背景只有直射光,故被照耀的物体比背景亮,称明反差( )或负反差( )。如用另一种相差物镜的相板,把衍射光推延波长,直射光的衍射光的相位差变成波长,由它们干预合成的光波振幅为二者振幅之差(图、),故被照耀物体比背景暗,称暗反差( )或正反差( )。相差显微镜的装置和一般显微镜不同者是前者聚光镜下加环状光阑.物镜里装有相板。另外有调轴望远镜。不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑。因此环状光阑有、等不同直径的,装配在一个旋转盘内,按须要调换运用。物镜的相板上有一个半透亮环,环和环以外的部分涂有不同的物质,使通过的光线产生确定的相

15、位差,以获得明反差或暗反差效果。用显微镜目镜看不清光阑亮圈和相板的环状圈。只有用调轴望远镜方能看清晰,以便转动调整装置,使两个环圈重合对齐。这样才能发挥相差显微镜的效能,看清活细胞的构造。相差显微镜的光源要用强光,并运用波长较短的单色滤光玻璃,通常用绿色玻片。、荧光显微镜 某些物质受紫外线照耀时发出荧光(可视光线),这种物质称荧光物质。例如维生素、核黄素、硫胺素等都是细胞内的自然荧光物质。用荧光显微镜( )可以视察这些荧光物质在细胞内的分布位置。另外给细胞中参加荧光染料(如中性红、甲基绿、吖啶橙、吖啶黄、刚果红等)可使细胞中某些物质受紫外线照耀使诱发出荧光。例如固定的切片标本,用吖啶橙染色,经

16、紫外线照耀时可使细胞内的核糖核酸()发生红色荧光,脱氧核糖核酸()发生绿色荧光。荧光显微镜通常采纳高压水银灯等做为发生紫外光的光源。在光源和反光镜之间放一滤光装置,把紫外线经过集光器照耀到被检物体上使之发生荧光。此外,在荧光显微镜的接物镜上方或目镜下方的镜筒中装设另一个滤光镜,把剩余的紫外线汲取掉,以爱护眼睛,但使荧光可以通过。这样就可通过目镜视察细胞中的荧光现象(图)。荧光显微镜有时在光源及标本间所用的透镜是用石英制成的,反光镜是涂铝的或为石英三棱镜。 ，电子显微镜( ) 可见光的波长制约了一般光学显微镜的辨别实力。人们在考虑可能交换的光源。年有人发觉了磁场对电子束的聚焦效应，接着鲁斯卡()

17、借助于磁力线圈把电子束聚焦于尽可能小的点上。这两项讨论成果奠定了制作电子显微镜的根底。年鲁斯卡等人通过试验证明了和光学成象的几何原理一样，电子照耀的物体也可以用磁电子透镜分二次放大的形式显示出来。年鲁斯卡制成了第一台电子显微镜，这台电镜被看作是当代各种型号电镜的祖先。他得到了 的图象。由于当时电镜技术尚不完善，他们讨论的物质常常被猛烈的电子束碳化。年鲁斯卡极大的改善了电子显微镜，西门子公司开场批量消费并胜利的将电子显微镜推向了市场。年鲁斯卡及扫描隧道显微镜的独创人拜宁（)等一起被授于诺贝尔物理奖。鲁斯卡在高龄得到这次殊荣，是为了嘉奖他在岁时独创的电子显微镜，他可能是历史上最老又最年轻的诺贝尔奖

18、获得者。电子显微镜和光学显微镜的几何成象原理虽然一样,但辨别本事却有了显著的进步.这首先是由于电子显微镜是用电子束作为照明的光源.电子束的波长远比光波的波长短.其次,电子显微镜运用的是电子透镜。光学透镜是由玻璃制成的可见物质透镜.及此相反，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜,他是由磁或电所行成的部分空间来起透镜的做用.正如光学透镜使光线入射到玻璃时产生折射一样,电子束经过电子透镜也会产生折射.电子透镜共有三组,分别起类似光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜(投射镜)的作用。 在电镜中,透过被检物的电子束投打到荧光屏上，电子能转换成光能,成为我们可视察到的影象。也可以让电子投射在感光板上,拍被检物的相片。

19、那么电子束是怎么成象的呢?它和光学象的形成有何不同？在光学显微镜中，成象的反差度,即亮度差,是因被检物的不同构造汲取光线的强弱程度不同造成的。就是说,入射电子及物质原子碰撞后产生散射,被检的不同部位有不同的散射度,这样就形成了电子象的浓淡.电子束的散射度是由物体的密度及厚之积,以及加速电压的大小确定的。 电子显微镜的构造是由镜筒(本体构造) 真空系统和供电系统三部份组成。 镜筒是由照明系统，标本室,成象系统和照相装置组成。最上部是做为电子源的电子枪.给其中的金属丝(钨丝)加热到达高温时电子就会从金属外表放射出来。放射出来的电子带负电荷,可背万伏的高压电加速。电压越高电子加速越大，电子运动速度大

20、致及电压平方根成正比.加速的电子束经第一个电子透镜（聚光镜）集拢并调整强度，照耀到试料标本上.然后在第二个电子透镜(物镜)成象和放大.物镜是电子显微镜的心脏.第三个电子透镜是投影镜（目镜）它起把物镜放大的象再放大的做用，即仅放大镜的作用. 所以，从镜筒的主要部分的构成看,电子显微镜和光学显微镜是相像的。但由于电子显微镜中是运用电子束代替照明的光源，故在构造上有以下主要特点： ()空气对电子束起明显的阻碍做用，因此镜筒必需保持高度真空。所以电镜要装备真空泵装置。 ()装备有加速电子用的高压电源. ()为电子束的波长单一化,装备有稳压装置。 ()为使电子象变成肉眼可见的光学象，在视察部位上设置荧光

21、屏（视察室）和照相室. ()放大倍数高的电镜在物镜和投影镜之间还装置一个中间镜,以多一级放大。调整中间镜的电流,可在很大范围内变动放大倍数。 电镜视察的标本必需是特别枯燥的，同时切片必需很薄(一般位)因为电子束是一中带电的粒子流,进入被检物体后及物质的电子和原子核发生作用而散射，故只能透过极薄的物体。 近年来，电镜的讨论和制造有了很大的进展。一方面电镜的辨别率不断进步，透射电镜的辨别率由最初鲁斯卡独创电镜的进步到了，晶格辨别率已接近;另一方面除透射电镜( )、扫描电镜( ) 分析电镜( )外，还开展了其他种电镜。如高压电镜( ),加速电压在以上的电镜即为高压电镜，假如电压超过就称为超高压电镜。

22、目前世界上最高的加速电压可以到达，电镜体积浩大，相当于二层楼房的高度。高压电镜主要特点是穿透力强，可用于视察较厚的样品，整体培育的细胞不需超薄切片即可视察内部的三维微细构造，如微丝、微管等。 扫描隧道显微镜( ,简称 )。 人类恒久不会停顿对微观世界的探究，在电子显微镜独创大约半个世纪后，年拜宁（）等又独创了扫描隧道显微镜它的成象原理完全不同于光镜和电镜。基于量子力学原理，讨论者们开展出了一系列高辨别显微镜。这些独创为人类翻开了通向微观世界的一扇又一扇大门，使人类真正进入了纳米世界。 是这类显微镜的代表，它能探究微观世界物质外表原子排列的状况。的探头有一根探针，针尖只有一个原子的大小，探针的针

23、尖接近但不接触观测样品的外表并且同时进展扫描.依据量子物理学原理，当针尖上的原子及样品外表的原子的间隔 小于纳米时，针尖和样品间会产生隧道效应，即产生隧道电流.通过记录隧道电流的变更就可以获得样品外表原子排列的状况并把它转化为图像。 具有其他显微镜不行比较的功能和特点：（）具有高辨别实力。它平行于物体外表的辨别率,即侧分辩率可以到达，而垂直于物体外表方向的辨别率,即纵分辩率可以到达纳米。（）具有搬移实力。不仅可以干脆视察物质外表的原子排列状况，而且还可以通过探针对物质外表的原子或分子进展搬移.从而人们可以按着自己的意愿在原子程度上进展重构或组建新的材料。（）具有刻蚀实力。能对物质外表进展刻蚀，

24、通过计算知道一个大头针大小的地方就能记录下来象”红楼梦”那样的一部书.这为制作高密度信息储存文件和纳米的电子原件供给了新途径。（）具有在多种多样下的工作实力。对于生物学讨论尤其重要的是可以在真空、大气等多种条件下工作。（）不破坏样品，在工作时既不接触样品又没有高能电子束的轰击.因此，可以避开样品的变形。总之，的视察到的原子是目前人类所能干脆看到的微观世界的最小尺度，这项技术已广泛应用于生命科学的讨论领域。用得到的照片使人类第一次清晰的看到了它的外表形态。可以确定，等基于量子力学原理创立的显微镜将在纳米生物学讨论领域发挥越来越重要的作用。第二节 细胞组分及功能的分析方法首祖先们利用一系列显微镜对

25、细胞及其构造进展了卓有成效的视察，并且结合一些化学手段确定了细胞器及一些大分子聚合物在细胞中的排布.如对细胞膜、细胞核、染色体、细胞分裂等的视察。在深化讨论中人们不禁要问，这些细胞构造的化学组成如何？它们在执行着什么样的功能？要解决这些问题只靠视察手段就不够了。随着科学技术的开展人们逐步创立了一系列分析细胞组分及功能的方法。这些方法大致可分为三种：第一种方法是把细胞及大分子分别出来进展讨论，即分别分析法；第二种是不破坏细胞或组分，在原位进展组分和功能的讨论，既原位分析法.第三种则是在细胞或细胞组分生活状态下进展的动态分析法。当然视察方法和分析的方法并没有严格的界限。正是视察方法和分析方法有机的

26、结合才使得细胞生物学有了长 足的进步。 一、分别分析法 、细胞分别技术 要对不同类型的细胞及组分进展详尽的分析讨论，首先要得到确定量的同一类型的细胞，进而才能得到纯化的细胞器及其它细胞组分。 可以用蛋白水解酶（胰蛋白酶和胶原酶）和钙鏊合剂乙二胺四乙酸（)处理组织，从中得到大量分上散较好的细胞悬液。再利用细胞不同的物理性质，通过沉降和离心把大小不同的细胞或轻重不同的细胞分别开。 利用免疫技术分别细胞是比较先进的方法。将某一种类型细胞外表特异性抗原的抗体及某种材料结合（如胶元、多糖小珠或塑料）形成集合外表。这样当各种细胞通过这一集合外表时，只有被这种抗体识别的细胞才能粘附在集合外表，然后用稍微的振

27、荡或用酶破坏可溶性基质（如胶元）就可将同一类型的细胞回收。 目前流式细胞术和分类术（ , )是一项较新的开拓性技术，可以用此项技术来分别细胞。首先要用荧光染料偶联的抗体来标记须要分别的细胞，然后将这种混合的单细胞悬液样品和鞘流液（蒸馏水或等渗盐水）由气体压力装置送进流淌室，使样品和鞘流液同轴流淌。鞘流管末端成圆锥形，具尖端有直径的孔，这样迫使细胞排成单行流出鞘流管尖端小孔进入样品流及激光束穿插区既检测区。通过振动乱流淌室时细胞流束已成为小水滴。荷电环系对带有荧光细胞的小水滴充电。当带电小水滴通过高压偏转板时，充电的小水滴就会偏离原来的流向，而不带电的小水滴（其中含有未标记细胞）不偏向。搜集偏向

28、的小水滴就可以得到大量标记的特殊细胞。 现代流式细胞术是结合计算机科学、激光技术、单克隆抗体制剂、定量细胞化学等的一项综和技术，它不但可以分别细胞而且还可以测量细胞的多种参数，其中包括象细胞大小、形态等不经染色处理就可干脆测量的固有（)参数，还包括经过的荧光剂染色后可测出的细胞含量、含量和细胞总蛋白量等的外源（)参数。例如当排成单列的细胞通过激光束时，荧光染色的单个细胞受到激光束的激发，会产生荧光信号，信号检测器可测定出标记细胞上的荧光强度。从而对很多外源参数进展测定（表 ）。 流式细胞计可在小时内分类搜集一亿八千万个细胞，纯度可达。可在分钟内测出个细胞的、蛋白质含量和细胞体积。此仪器应用广泛

29、但价格特别昂贵（图 ）。 、细胞器及生物大分子的分别技术 通过细胞分别方法可以得到纯化的细胞群体，并且可以在细胞整体程度上进展讨论。假如要深化讨论各种细胞器及细胞内含物就须要用低渗、超声波等方法使细胞崩解，造成细胞匀浆，这一 过程叫做细胞的匀浆化（)。然后便可以依据须要将亚细胞组分或各种颗粒分别分别出来。分别的方法主要应用的是离心技术。 离心机是一种借离心力把颗粒从中心向外推移的机器，当离心力超过地球引力时，悬浮在液体里的颗粒就会分开中心向外沉降。用一般离心机可以很快使红细胞沉降下来，也可把鲜奶分成奶油和较重的脱脂奶两部分。然而要分别亚细胞构造只有一般离心机是不够的。年头，瑞典化学家斯维德伯格

30、（ )独创了一种超速离心机，它的转数可达每分钟十几万转，产生的离心力相当于地心引力的几十万倍。超速离心机的出现极大的推动了细胞生物学的讨论.有了一系列离心机还不够，为了更准确的分别讨论对象，人们还创立了各种离心方法以适应不同讨论层次的须要。() 差速离心法（ ) 差速离心法是利用不同的离心速度所产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分别开.匀浆液在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底部的速度不同，当离心力不高并且离心时间不长时，细胞核首先沉到管底。取出上清液进展离心并加大离心力，这时可分别出线粒体，这样进展下去不断增大离心力，最终可分别出核糖体(图 )。怎样对分别出的物质进展纯度鉴别呢

31、？一般有两种方法，一种是用电镜作形态学鉴定。更为简便的是利用各种细胞器的特征酶或特殊分子做生化分析。 用差速离心法对细胞器的分别只是初步的，要获得比较纯的细胞器还须要进一步的分别纯化。另外，经离心分别出核糖体以后所剩的上清液是可溶性部分和极微小的颗粒及一些生物大分子所组成。这些成分须要用更严格的超速离心才能分别出来，为此人们又开展出了密度梯度离心法。()密度梯度离心法( )这种方法是利用离心溶液形成梯度来维持重力的稳定性和抑制对流的。这须要在溶液中参加化学惰性物质，如蔗糖、甘油及盐类（如氯化铯、氯化铷）。这些物质不影响分别物的物理及化学性质，分别物的密度确定要在梯度柱密度的范围内，经高速离心后

32、，不同密度的分别物就会集中在等密度带中而得到互相的分别. 蔗糖密度梯度离心 这种方法比较合适于对细胞器的进一步分别（表 ）。这须要预先制成不同浓度的蔗糖液（一般浓度在或）。用确定的方法在离心管中做成自下而上递减的浓度梯度，将待分别的悬液加在最上面，经超速离心，不同大小、密度的颗粒由于沉降速率不同，它们将会分别集中在不同的区带中，这样就到达了分别它们的目的(图 )。 氯化铯（)密度梯度离心 氯化铯是重金属盐类，它的溶解度高，其溶液密度可达，它在离心场中会自动形成密度梯度。用来分别的物质可干脆和金属氯化铯溶液混合，然后进展等密度离心。这种方法合适于测定大分子或颗粒的浮力密度（图 ）。也就是说，它是

33、依据检测对象的浮力密度的差异而不是依据他的大小来进展分别的.比方线粒体、溶酶体或过氧化物酶体的大小相近，但密度不同，我们可以依据浮力密度对它们做进一步的分别。这种方法的准确和灵敏是令人信服的，早在年人们就用氯化铯密度梯度离心技术将含有标记的细菌和未标记的细菌分子分别开，这个经典试验干脆证明了的半保存复制。利用离心特殊是超速离心技术对细胞及其组分进展分别分析,在细胞生物学的讨论中起着极重要的作用。例如，从对分别纯化出的线粒体和叶绿体的讨论中人们理解到了这些细胞器在能量转化过程中的作用。用分别分析方法可以使内质网和高尔基体的封闭泡互相分别开。粗糙内质网经分别形成的小泡称微粒体（)，它给内质网的讨论

34、带来了极大的便利.正是对微粒体分别讨论使我们得到了关于分泌蛋白合成机制等很多成果。又如，在蛋白质合成机制的讨论中，当时发觉在细胞粗提液中能使翻译成蛋白质。然后将粗提液分步分别，依次得到了核糖体、和各种酶，是否是这些物质构成了蛋白质合成体系呢？我们可以向这个体系中参加或不参加各种纯组分，这样就可以讨论出每个组分在整个过程中发挥准确作用。事实上，在讨论细胞及其组分的功能过程中,分别分析的方法是在构建一种非细胞体系（ )。这种体系来源于细胞，但不具有完好的细胞构造，它包含了部分细胞提取物，这些提取物可以进展正常的生物学反响。用这种方法使细胞中各种生物学过程互相分开，不受细胞中困难副反响的干扰，因此可

35、以确定这些生物学过程的具体的分子机制。近年来，非细胞体系有了更广泛的应用，以非洲瓜蟾卵提取物非细胞体系为例，来自非洲瓜蟾的卵首先去胶膜后，经活化、裂解、然后超速离心，去掉上层脂类和下层卵黄、色素颗粒后剩下的提取物即是非细胞反响体系。向该体系中参加外源，孵育一段时间后即可重构成新的细胞核。人们利用这一体系讨论讨论了很多细胞生物学的重要问题。如细胞周期调空、复制，核膜及染色质组装、核质运输等。须要说明的是,离心技术有二个主要参数.一是离心力，一般用离心机的每分钟转数（)来表示。文献中也常常干脆用离心力（)来表示。它们之间的换算关系是： 。二是沉降系数（ ），它是用来表示大分子沉降速度的，各种大分子

36、颗粒均具有确定的沉降系数。为了纪念诺贝尔奖获得者斯维德伯格，沉降系数的单位用了他的名字命了名，即斯维德伯格单位（ )，秒，简称。二、细胞的原位分析方法人们除了用分别的方法对细胞进展讨论外，同时还开展出了一系列对细胞进展原位分析的方法。顾名思义，这种方法要求被测定的物质必需保持在细胞的原来位置不动。一般的细胞化学方法都属于这一类。比方为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分，通常利用一些显色剂及被检物质中一些特殊基团特异性的结合，通过这种结合所产生的颜色和颜色深浅度的不同来推断各种物质在细胞中的分布和含量。四氧化锇及不饱和脂肪酸反响呈黑色，用以证明脂肪滴的存在。用氮汞试剂及组织中蛋白质侧链上的

37、酪氨酸残基反响,形成红色沉淀。这是闻名的米伦()反响。原位分析的方法很多，我们在这里仅作一简洁的介绍. 免疫细胞化学法在一些经典的蛋白质细胞化学反响中，如米伦反响、重氮反响等，都只是一种一般蛋白质的定位反响，假如想理解其一特殊蛋白质的状况须要用特殊蛋白质的原位分析法。近些年开展起来的免疫细胞化学法（)创始了这方面讨论工作的新领域.这项技术主要是利用抗原和其相应的抗体能作特异性结合即免疫反响这一原理，来定位组织或细胞中蛋白质抗原成分的一类技术。我们可以利用这一技术来对蛋白类抗原进展定位定性分析。虽然抗原和抗体的结合具有高度的敏感性和特异性，但是抗体及抗原的结合是看不见的，为理解决这一问题，早在四

38、十年头奇妙的使荧光素和抗体项结合，然后用这种被标记的抗体同被检测的抗原进展免疫反响，这样就很简洁在荧光显微镜下检测到组织或细胞中的抗原物质。从而创立了这项技术.后来，用于标记抗体的物质不断得到改良，先后出现了免疫酶标记技术、免疫铁蛋白技术。特殊是年和创立的免疫胶体金技术是目前最受欢送的免疫电镜技术。这项技术的特点是，胶体金能快速而稳定地及蛋白质即抗体相结合.这是一种由于蛋白质被胶体金外表负电荷吸引而结合的过程。这种结合主要是物理过程，不会影响蛋白质的活性.另外金颗粒简洁识别，能产生猛烈的二次电子，是志向的扫描电镜的标记物。今日，免疫电镜技术已得到了广泛的应用，如分泌蛋白的讨论、胞内酶的讨论、一

39、些构造蛋白的讨论，包括膜蛋白的定位及细胞骨架蛋白的定位等。胶体金不但能及免疫球蛋白即抗体相结合形成金标记抗体，而且还可以同其他蛋白相结合形成金标记酶、金标记凝集素等。因此金标记酶不仅可用于光镜和电镜的免疫细胞化学技术，还可以用于其它物质的检测。 孚尔根()反响 年德国化学家 孚尔根（ )在讨论核酸时找到了一种方法，它只能使着色，而不着色。他发觉在细胞核里，特殊是在染色体里。他用此方法证明，普遍存在于动植物细胞核中。后来，人们称这种能特异显示存在部位的方法为孚尔根反响。这一技术的根本步骤是：首先用酸处理已固定好的材料，酸水解可以除去,保存，并在的嘌呤脱氧核糖苷键程度上除去嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴

40、露。然后用希夫试剂()处理，所暴露的自由醛基就会及希夫试剂起反响而呈现紫红色.在显微镜下可以看到紫红色的核，无色的胞质和核仁,即细胞核的福尔根反响为正，而胞质为负反响。核中异染色质区为强的正反响，核仁为负反响。 原位杂交技术 福尔根技术可使我们理解到一般在细胞中的存在位置.但假如我们想知道某段特殊核苷酸依次在染色体上或在细胞中的准确位置，福尔根技术便无能为力了，这须要用原位杂交技术。 原位杂交（ )是一项核酸分子杂交技术（ )。其原理是，两条具有互补核苷酸依次的单链核苷酸分子片断,在确定条件下通过氢键的结合形成或 的双链分子。进展原位杂交首先要制作探针，即对一段特异的核酸序列进展放射性同位素或

41、荧光素的标记.然后要把所要讨论的样品如细胞或染色体固定于载玻片上,并使或原位变性,再注入探针，使样品及标记的核酸进展原位杂交反响。将未反响的标记核酸分别后，用放射自显影术或萤光技术对杂交分子进展视察和定位。例如，年等从细胞的多核糖体中分别出，并以标记制成探针，并测探出的基因在染色体上的位置。具体过程是这样的，首先对载片上的人体细胞中期染色体进展原位变性，并参加探针.这时，探针只能和产生它的模板互补，即进展分子杂交，而其他部位则不行。放射自显影暴露二个月后，发觉在全部制片的染色体组中，一对一号染色体均被标记，标记的位置是短臂末端，这说明基因位于第一号染色体的短臂末端。原位杂交技术首先是在光镜程度

42、上开展起来的。近年来随着免疫电镜技术的不断进步，电镜原位杂交技术也得到了开展。电镜原位杂交和光镜原位杂交的根本原理是一样的，区分是探针的标记物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或萤光素来标记特异核苷酸序列来制作探针进展原位杂交。然后用及胶体相连的生物素的特异性抗体对原位杂交样品进展免疫反响，这样就可在电镜下视察到探针的位置，从而把特异核酸序列的定位及细胞的超微构造分析结合了起来。 三、 细胞动态分析的方法 事实上，在生活状态的细胞中生物大分子总是呈现动态变更的。人们早就盼望能找到一些方法,可以对生物大分子进展动态的分析讨论. 第一位在这个方向上努力的是德国生物化学家努普（ ）。早在年他就

43、用苯环标记脂肪分子对脂肪代谢进展讨论，得出了在体内脂肪代谢过程中脂肪分子每次断裂下两个碳原子的结论。这个结果被年后的进一步讨论所证明。年德国化学家帕内斯（ ）等人想到可以用放射性同位素标记生物大分子来讨论大分子在细胞中的活动和代谢状况。这样就有了放射自显影技术（）。 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对含有乳胶的感光作用来讨论生物大分子在细胞内代谢过程的一种技术。开场，帕内斯等曾用放射性铅作为标记，然而铅的同位素极简洁打乱活细胞正常的代谢过程。后来渐渐探索到了一些常用的同位素（表 ）。这些同位素都是细胞生命活动中根本的起重要作用的元素。放射性同位素技术所以能被应用是由于存在两个根本条件

44、，一是放射性同位素不影响机体的正常代谢。二是机体细胞对某种元素及其不稳定同位素“一视同仁”。该项技术的应用使得细胞生物学获得了很大的进展.例如象柠檬酸循环，尿素循环过程的发觉；首次证明核仁是合成的场所；半保存复制的证明等都是应用这项技术得到的成果。 制造带有放射性同位素的小分子并不困难，只要把一般化合物放在核反响堆里用中子轰击，取出后就带有放射性同位素了。如今用于标记的几乎全部小分子前体都可以通过商品销售得到。因此如今这项技术的应用已特别广泛。这种方法的根本过程是，先使细胞含有示踪原子（例如或其他）的化合物，然后把这种组织细胞做成切片，使液体乳胶涂于其上，经过确定时间的暴光（即放射性物质放出的

45、射线落在乳胶上使其溴化银复原而析出金属银，这个过程称为自显过程，亦称曝光），再进展显影和定影。依据乳胶上出现的银粒在细胞中的位置，便可推断放射性物质（或由这种放射性物质以及其他物质合成的化合物）在细胞内的分布.这种方法的根本过程是,先使细胞含有示踪原子的化合物，然后把这种组织细胞制成切片，使液体乳胶涂及其上，经过确定的时间暴光(即放射性物质放出的射线落在乳胶上使其溴化银复原而析出金属银,这个过程称为自选过程，亦称暴光),在进展显影和定影手续。依据乳胶上出显的银粒在细胞中的位置，便可推断放射性的物质（或由这种放射性物质以及它物质合成的化合物）在细胞内的分布. 自显过程的具体操作步骤是：()将染色

46、或未染色的切片标本先覆盖一层明胶爱护膜;()在暗室将凝胶壮液体加热溶化，然后将盛乳胶的小杯放入摄氏度的水浴锅中，再将切片浸入乳胶内片刻；()取出载片，立于染色缸内自干,或揩去载片被面的乳胶，平放在温台内烘干;()将枯燥的乳胶片放入暴光暗匣内,再摄氏度低温下暴光;()显影 定影后，再用常规方法制片,最终用树胶封藏. 制备电子显微镜的放射自显影标本的程序是把用等放射性同位素标记的化合物引入组织细胞,制成超薄切片,放在有支持膜(火棉胶加碳)的载网上，喷碳膜后再涂一薄层核乳胶。然后放在暗处暴光（暴光时间的长短视条件而不同,例如温度,切片中放射性物质的量和半衰期等，常要靠理论来确定,一般要几周乃至数月的

47、时间）,暴光后进展显影 定影和冲洗.再经电子染色制成的标本即可在电镜下视察(图 )。 放射自显影术不但在定位讨论上有灵敏度高，定位准确的特点，它还是动态讨论中最有效的手段。针对活细胞一般都采纳放射自显影的追踪标记也称脉冲标记()的方法。这种方法是先用带同位素标记的前体分子掺入到生活细胞的代谢中去，标记一段时间后便把它彻底洗掉，再用不带标记的前体分子代替。然后在不同时间取样并分析同位素的量和它所在的位置，从而理解它们的代谢途径。很多生物大分子在细胞中的合成、修饰、排出、蓄积、更新等作用的机制和部位的讨论结果都是利用脉冲标记的方法得到的.第三节 细胞培育和单克隆抗体技术一 细胞培育在细胞生物学及其它有关细胞的讨论中，如何获得足够的高质量的细胞始终是一个须要解决的根本问题。特殊是高等动物或人的细胞.从生物个体上取细胞不但费用贵而且不便利。解决这 一问题的