代谢物酶法分析技术.ppt

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1、代谢物酶法分析技术现在学习的是第1页，共57页 第五章 代谢物酶法分析技术江苏大学江苏大学 郑铁生郑铁生全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）现在学习的是第2页，共57页教学目标与要求教学目标与要求v掌握：掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、酶代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示系统促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。v熟悉：熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶活性恢代谢物酶法分析技术的理

2、论基础，酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法和速率法的优复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法和速率法的优缺点。缺点。v了解：了解：试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的发展试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的发展前景。前景。3现在学习的是第3页，共57页v代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 v酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。 代谢物酶法分析技术的概念代谢物酶法分析技术的概念4现在学习的是第4页，共57

3、页目录目录 代谢物酶法分析的理论基础1代谢物酶法分析的方法 2代谢物酶法分析的设计要求 3小结与展望4返回总目录5现在学习的是第5页，共57页 代谢物酶法分析 平衡法（终点法） 速率法（动力学法） 代谢物酶法分析的理论基础16现在学习的是第6页，共57页v平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-point method)。v 平衡法的特点是测定底物的总变化量，平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是即测定的是“浓度浓度”。平衡法基本理论(1)7现在学习的是第7页，共57

4、页 SKmSVvmax SKmSVdtSdvmax dtSVSKmSdmax)( dtVSVKmSd)max1max( maxlgmax303. 200VSSSSVKmttt积分得： 米氏方程 改写为 式中式中 S0 为待测物，为待测物， St 为为待测物至反应待测物至反应t时间后的浓度。时间后的浓度。平衡法基本理论(1)8现在学习的是第8页，共57页若反应达到平衡，假设 ，即 S0St S0， %10SSt maxlgmax303. 200VSSSSVKmttt以上积分式： 则可简化为：则可简化为：maxmax606. 40VSVKmtv说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、S0有关，Km

5、越小、Vmax越大（加入酶量越多）、S0越小（待测物越少）则达到平衡所需的时间越短。平衡法基本理论(1)9现在学习的是第9页，共57页若 S0 Km dtSVKmSdmax dtSVSKmSdmax)( tSSVKmt0lgmax303. 2积分得： 可简化为： 若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应时间（t）一致，则有： ttSSlgSSlg测定管测定管标准管标准管00ttSSSS测定管测定管标准管标准管00平衡法基本理论(1)10现在学习的是第10页，共57页 ttttSSSSSSSS0000测定管标准管测定管标准管测定管标准管 标准管的 S0St 与待测管的 S0S

6、t 分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的S0与测定管的S0分别表示为Cs和Cu。AuAsCuCs可简化为： 平衡法基本理论(1)11现在学习的是第11页，共57页AuAsCuCsv当 S0St S0，即反应基本达到平衡，Au和As基本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。此式是平衡法测定代谢物的基本原理此式是平衡法测定代谢物的基本原理 ttttSSSSSSSS0000测定管标准管测定管标准管测定管标准管此公式成立是前提条件此公式成立是前提条件平衡法基本理论(1)12现在学习的是第12页，共57

7、页v速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。 速率法基本理论(2)13现在学习的是第13页，共57页 SKmSVvmax根据米氏方程： v当当 S Km，则，则 S + Km Kmv当酶量固定不变时，酶促反应的当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度最大速度Vmax也不变也不变符合一级酶促反应符合一级酶促反应 SKKmSVvmax米氏方程改为： 速率法基本理论(2)14现在学习的是第14页，共57页若同时带标

8、准管，则有：SSvv测定管标准管测定管标准管v标准管的S0与测定管的S0分别表示为Cs和Cu，速度用 A/min来表示。上式改写为：CuCsmin/min/测定管标准管速率法测定代谢物浓度的原理 v前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。速率法基本理论(2)15现在学习的是第15页，共57页v在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中，因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。 21现在学习的是第21页，共57页在340 nm 处测定吸光

9、度的增加来进行定量的方法乳酸测定乳酸测定双底物反应直接测定法 LD乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+丙酮酸测定 在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法 乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+LD22现在学习的是第22页，共57页v酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。 v最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。ACBAEiEa 酶偶联法(2)23现在学习的是第23页，共57页脱氢酶指示系统 氧化型辅酶氧化型辅酶NAD(P)+在在34

10、0 nm 处没有吸处没有吸收峰收峰, 还原型辅酶还原型辅酶NAD(P)H在在340 nm 处有吸收峰处有吸收峰.24现在学习的是第24页，共57页脱氢酶指示系统 v以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+) 或氧化型辅酶(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处吸光度的下降来计算被测物的浓度。 25现在学习的是第25页，共57页脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu + ATPG-6-P+ADPPDG 6G-6-P + NADP+P

11、-6-GA + NADPH + H+v指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比 26现在学习的是第26页，共57页脱氢酶指示系统 血清尿素测定 尿素尿素 + H2O 尿素酶2NH3 + CO2NH3 + -酮戊二酸酮戊二酸 + NADH + H+ 谷氨酸谷氨酸 + H2O + NAD+v测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定 27现在学习的是第27页，共57页v常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。v体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁体液葡萄

12、糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示系统。系统。脱氢酶指示系统 28现在学习的是第28页，共57页过氧化物酶指示系统 共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为Trinder反应 v最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定 29现在学习的是第29页，共57页过氧化物酶指示系统 血清总胆固醇氧化酶测定法 COD胆固醇酯胆固醇酯 + H2O胆固醇胆固醇 + O2胆固醇胆固醇

13、+ 脂肪酸脂肪酸4-胆甾烯酮胆甾烯酮 + H2O2红色醌类化合物红色醌类化合物H2O2 + 4-AAP + 酚酚v指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定 30现在学习的是第30页，共57页化学名英文缩写最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统 常用的Trinder反应生色基团 表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有

14、些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。 31现在学习的是第31页，共57页利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。 酶循环法(3)32现在学习的是第32页，共57页v使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(

15、或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。v检测指示系统： 循环前、后用速率法测定NADH(340 nm) 的变化。检测产物H2O2可通过Trinder 反应比色测定。产物循环氧化酶脱氢酶系统 33现在学习的是第33页，共57页产物循环氧化酶脱氢酶系统 甘油浓度测定 v通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计的量决定于t 和每min循环次数。 34现在学习的是第34页，共57页底物循环脱氢酶辅酶系统v用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+

16、和NADH)。用395 nm 415 nm 波长测定反应中氧化型thio-NAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。v循循环反应条件：环反应条件： v酶对酶对thio-NAD+ 和和NADH应有高度亲和力。应有高度亲和力。v溶液溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。和缓冲体系同时有利于双向反应。vthio-NAD+ 和和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。二者的浓度和配比达最适条件。 35现在学习的是第35页，共57页底物循环脱氢酶辅酶系统血淸胆汁酸测定 胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。

17、 36现在学习的是第36页，共57页氨循环合成酶脱氢酶系统 vNH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。 37现在学习的是第37页，共57页酶循环法具有的特点 v灵敏度随反应时间的延长而提高v灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高v利用酶对底物的特异性,使测定系统简化v利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定 38现在学习的是第38页，共57页酶活性恢复法 v很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之

18、后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。 其他酶法(4)39现在学习的是第39页，共57页异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法酶活性恢复法MgDIC异柠檬酸异柠檬酸+ NADP+-酮成二酸酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+v用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。 40现在学习的是第40页，共57页酶活性恢复法应用举例酶活性恢

19、复法应用举例v丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子v-半乳糖苷酶法测定钠离子v淀粉酶法测定氯离子v超氧化物歧化酶法测定铜离子v碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 41现在学习的是第41页，共57页激活和抑制法 v有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。有机磷的酶法测定有机磷的酶法测定v根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。v另有抑制另有抑制ALP法测定茶碱

20、、激活法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。法测定镁离子等。返回章目录42现在学习的是第42页，共57页试剂酶质量试剂酶质量试剂酶概念 试剂酶特征 试剂酶纯度酶法设计要求 酶法设计共性要求 平衡法设计的要求 速率法设计的要求 代谢物酶法分析的设计要求 3试剂酶来源试剂酶来源43现在学习的是第43页，共57页v试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。试剂酶的质量要求(1)试剂酶的概念试剂酶的概念44现在学习的是第44页，共57页v主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。 v不同

21、来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。 试剂酶的来源和理化特征试剂酶的来源和理化特征试剂酶的质量要求(1)45现在学习的是第45页，共57页v不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。 v纯度主要指标 酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。 试剂酶的质量要求(1)试剂酶的纯度要求试剂酶的纯度要求46现在学习的是第46页，

22、共57页表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求 名称来源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum186 000152 0004.3020蔗糖酶含量0.01%,过氧化氢酶10U/mg蛋白己糖激酶(HK) 酵母105 0004.50-4.80140磷酸葡萄糖异构酶0.01%,G-6-P脱氢酶0.01%葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)酵母212 0004.50140己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶0.02%过氧化物酶(POD)辣根40 2007.2050不含胺氧化酶及过氧化氢酶47现在学习的是第47页，共57页名称来源分子

23、量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）脲酶巨豆483 0004.905-100天冬氨酸酶0.02%,精氨酸酶0.002%,NH4+0.0005g/U,谷氨酸脱氢酶(GLDH)变形杆菌300 0004.6090醇脱氢酶、乳酶脱氢酶、苹果酸脱氢酶0.01%乳酸脱氢酶 心135 0004.5-4.8500丙氨酸转氨酶0.01%,丙酮酸激酶、醛缩酶0.001%脂蛋白脂肪酶（LPL）心，假单胞菌属47 0005.950.05100ATP酶0.00008%, NADH氧化酶0.001%,胆固醇氧化酶0.002%,过氧化氢酶0.02%甘油激酶（GK)嗜热脂肪芽胞杆菌209 000 85N

24、ADH氧化酶0.01%,己糖激酶0.02%48现在学习的是第48页，共57页名称来源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）磷酸-3-甘油氧化酶足球菌76 0004.60.140乳酸氧化酶0.001%胆固醇酯酶(CEH)假单胞菌302 000 25ATP酶0.00008, NADH氧化酶0.001%,GOD0.00001%,尿酸酶0.00004%,过氧化氢酶1U/mg胆固醇氧化酶(CHOD)链霉菌34 0005.1-5.425CEH0.005%,GOD0.00014%尿酸酶0.0004%胆红素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌52 0004.100.2NADH氧化酶0.0007%

25、尿酸酶肝100 0006.3015过氧化氢酶1.0%丙酮酸氧化酶 260 0004.301.5ATP酶0.05% ，ALT、AST0.05%49现在学习的是第49页，共57页v所用试剂酶的特异性：指示酶要有更高特异性； v怎样消除干扰因素：加消除剂、抑制剂和用双试剂法；v试剂中的附加剂：应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳定性，不与底物和体液中的物质作用；v如何提高灵敏度：用PMS或黄递酶，将NADH上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测； 用酶循环法； 测定荧光法。酶法分析的设计要求(2)酶法设计的共性要求酶法设计的共性要求50现在学习的是第50页，共57页v酶的用量要足够大，能使反应酶的用量要足够大

26、，能使反应1 min3 min 达到平衡，以达到平衡，以保证较快完成测定。保证较快完成测定。v反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH 等等方法方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。并设标准管一起到达平衡以后测定。v Km 在保证测定线性的前提下要尽量小。在保证测定线性的前提下要尽量小。平衡法设计的要求平衡法设计的要求酶法分析的设计要求(2)51现在学习的是第51页，共57页v所用酶的所用酶的 Km 应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态应足

27、够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。期。Km 太小，可加入竞争性抑制剂加大太小，可加入竞争性抑制剂加大 Km。v酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。v速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（度（v）才与代测物的浓度成正比例。）才与代测物的浓度成正比例。速率法设计的要求速率法设计的要求酶法分析的设计要求(2)52现在学习的是第52页，共57页区别速率法平衡法测定时间检测速度检测成本产物堆积样品色原测定仪

28、器较短较快酶用量小，成本低影响较小影响较小要求电噪声小，A读准到0.0001，温差0.1%较长较慢酶用量大，成本高影响较大影响较大要求不严 速率法和平衡法测定比较另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。 返回章目录53现在学习的是第53页，共57页【小结】4v酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及酶促反应测定酶活性的一类方法。、激活剂或抑制剂，以及酶促

29、反应测定酶活性的一类方法。代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。分为平衡法和速率法。代谢物或代谢产物的技术。分为平衡法和速率法。v平衡法测定的是底物的总变化量，即平衡法测定的是底物的总变化量，即 “浓度浓度”, 关键是要关键是要确定达到平衡所需的时间。速率法测定的是速度，关键是如何确定达到平衡所需的时间。速率法测定的是速度，关键是如何使酶促反应成一级反应。使酶促反应成一级反应。54现在学习的是第54页，共57页【小结】4v代谢物酶法分析技术可以分为：单酶反应直接法、酶促偶联法代谢物酶法分析技术可以分为：单

30、酶反应直接法、酶促偶联法、酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法等。最常用的、酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法等。最常用的偶联指示系统有脱氢酶和过氧化物酶指示系统。偶联指示系统有脱氢酶和过氧化物酶指示系统。v代谢物酶法分析具有许多优点，但测定的影响因素也不少，因代谢物酶法分析具有许多优点，但测定的影响因素也不少，因此，在方法设计中要注意试剂酶的特异性和纯度，要注意干扰的避此，在方法设计中要注意试剂酶的特异性和纯度，要注意干扰的避免和灵敏度的提高，速率法和平衡法的应用要得当等。免和灵敏度的提高，速率法和平衡法的应用要得当等。55现在学习的是第55页，共57页【展望】4v近几年来，活力高、杂酶少且价廉的基因重组酶蛋白已经面世，并开始应用于临床生物化学检验；v酶循环法发展潜力很大, 如与其他手段结合可使循环速度达到 1000 次/min ，灵敏度可望达到纳摩尔级，可用于甾醇激素的测定；v目前已设计出几百种酶试剂系统和测定方法，用于200多个临床生化检验项目，成为最有发展前途的分析方法。v可以预见将来，现有的分析方法将基本上被酶试剂方法所取代，可用于测定人体內所有代谢物及其产物。56现在学习的是第56页，共57页返回章目录57现在学习的是第57页，共57页