免疫检验第十三章免疫细胞分离与检测.ppt

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1、免疫检验第十三章免疫细胞分离与检测现在学习的是第1页，共36页密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)(Ficoll)离心离心现在学习的是第2页，共36页二二 、淋巴细胞分离（去单核细胞）、淋巴细胞分离（去单核细胞）贴壁粘附法贴壁粘附法 （单核细胞贴壁生长的特点、将悬液置玻璃或塑料器皿，未贴壁的为淋巴细胞，此法易造（单核细胞贴壁生长的特点、将悬液置玻璃或塑料器皿，未贴壁的为淋巴细胞，此法易造成成B B流失）流失）吸附柱过滤法吸附柱过滤法 （单核细胞贴壁生长的特点，将细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶的（单核细胞贴壁生长的特点，将细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶的层析柱中，洗脱下来的为淋巴

2、细胞）层析柱中，洗脱下来的为淋巴细胞） Percoll Percoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心，不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带）（连续密度梯度离心，不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带）现在学习的是第3页，共36页PercollPercoll法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图现在学习的是第4页，共36页 E花环沉降法花环沉降法（T细胞与绵羊红细胞细胞与绵羊红细胞 形成形成E花环后用淋巴细胞分层液分离，花环后用淋巴细胞分层液分离， E花环沉在管底）花环沉在管底） 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法（B细胞和单核细胞易粘附于尼龙纤维表

3、面，将用细胞和单核细胞易粘附于尼龙纤维表面，将用HANKS液浸液浸泡后的单个核细胞悬液加入充填有尼龙毛的聚乙烯塑料管内，洗泡后的单个核细胞悬液加入充填有尼龙毛的聚乙烯塑料管内，洗脱液中为脱液中为T细胞，然后边冲边挤压塑料管，洗下细胞，然后边冲边挤压塑料管，洗下B细胞。细胞。 三、三、T、B细胞和细胞和T细胞亚群的分离细胞亚群的分离现在学习的是第5页，共36页现在学习的是第6页，共36页现在学习的是第7页，共36页大小免疫磁珠分离细胞的特点比较大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对细胞造成机械压力，影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活

4、性，不利于分离其生物学活性，不利于分离后培养。后培养。对细胞温和，不影响分离细对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。胞的后续培养。对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。响散射光。可直接上流式细胞仪检测，可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。不影响散射光。分离条件要求分离条件要求技术简单，分离可在试管中技术简单，分离可在试管中完成。完成。需要很强的磁场来分离细胞需要很强的磁场来分离细胞。 收率收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。纯度纯度纯度低。纯度低。纯度高。纯度高。分离时间分离时间分离速度快。分离速度快。分离速度慢。分离速度慢。分离成

5、本分离成本成本低。成本低。需要很强的磁场来分离细胞需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不，需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。能在普通试管进行。现在学习的是第8页，共36页第二节第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗（常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗（CD）。）。 一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T细胞细胞 （help T cell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞 （cytotoxic T cell,Tc o

6、r CTL）CD4+CD25+ Foxp3 +调节性调节性T细胞细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）现在学习的是第9页，共36页辅助性辅助性T细胞细胞Th1（IL-2、IFN-、TNF- CD3+CD4+CD30- )Th2（IL-4、IL-5、IL-6或或IL-10 CD3+CD4+CD30+）现在学习的是第10页，共36页细胞毒性细胞毒性T细胞细胞Tc1（CD3+CD8+CD30- )Tc2（CD3+CD8+CD30+）现在学习的是第11页，共36页调节性调节性T细胞细胞CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞CD8+调节性调节性T细胞细胞现在学习的是第12页

7、，共36页二、二、B细胞表面标志细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体都是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 成熟B细胞的mIg主要为mIg M、mIgD。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。 三、三、NK细胞表面标志细胞表面标志 现在学习的是第13页，共36页第三节抗原提呈细胞表面标志的检测第三

8、节抗原提呈细胞表面标志的检测抗原提呈类细胞表面标志抗原提呈类细胞表面标志第四节第四节 淋巴细胞功能检测淋巴细胞功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。 体内实验主要是进行迟发型超敏反应，间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应. 体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定.现在学习的是第14页，共36页淋巴细胞分类淋巴细胞分类T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）NK和和K细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用）现在学习的是第15页，共36页1.

9、1. 原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松（一）（一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验现在学习的是第16页，共36页 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、

10、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无现在学习的是第17页，共36页2. 淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA -T细胞细胞 ConA -T细胞细胞 PWM -T、 B细胞细胞 LPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原现在学习的是第18页，共36页 同位素法：同位素法：PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h

11、） DNA合成期合成期 + + 3H-TdR掺入掺入 收集细胞收集细胞 检测检测射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3H-TdR3. 3. 检测方法检测方法形态法：刺激物形态法：刺激物 淋巴细胞（淋巴细胞（4-64-6天）天） 母细胞化母细胞化现在学习的是第19页，共36页（1 1）形态学检查法）形态学检查法%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率现在学习的是第20页，共36页方法学评价：方法学评价：优点：优点：形态学方法简便易行，普通光形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。室应用。缺点：缺点：是依靠肉眼观察形态学变化

12、，是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。准确性较差。 现在学习的是第21页，共36页（2 2）3H-TdR掺入法掺入法优点：优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。强，重复性好。缺点：缺点：但需一定设备条件，同时还存在但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。放射性核素污染问题。（3）MTT比色法比色法均值对照孔A均值试验孔A570nm570nmSI 现在学习的是第22页，共36页( (二二) ) T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺激

13、后细胞经各种丝裂原或抗原刺激后, ,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子, ,可借助免疫学、细胞生物学及可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映性或基因表达水平，以反映T T细胞功能。细胞功能。 现在学习的是第23页，共36页1.1.原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞（三）（三）T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验现在学习的是第24页，共36页形态学方法：形态学方法：淋巴细胞淋巴细胞+ +肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞计

14、数残留肿瘤细胞同位素法同位素法 ：淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）+ +含含51Cr的肿瘤细胞的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 释放释放 测定测定射线射线2.2.方法方法意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 现在学习的是第25页，共36页( (四四) ) 体内试验体内试验特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验皮肤试验 二、二、B细胞功能检测细胞功能检测溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验现在学习的是第26页，共36页2. 2. 方法学：方法学：经典溶血空斑形成试验经典溶血空

15、斑形成试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 (一一) 溶血空斑试验溶血空斑试验溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。能力。 现在学习的是第27页，共36页应用与方法学评价：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可

16、定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。( (二二) ) 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法现在学习的是第28页，共36页三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: : K562细胞株(人） YAC-1细胞株(小鼠）现在学习的是第29页，共36页形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法染色计数染色计数离心取上清测离心取上清测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀测活细胞荧光离心取沉淀测活细胞荧光测测CPMCPM值值测发光强度测发光强度方法学及原理方法学及原理现在学习的是第30页，共36页 吞噬细

17、胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作趋化、吞噬和胞内杀灭作用用三个阶段，据此建立相应的检测方法。三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一、中性粒细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术第五节第五节 其他免疫细胞功能检测技术其他免疫细胞功能检测技术现在学习的是第31页，共36页一、中性粒细胞功能的检测一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测现在学习的是第32页，共36页( (一一) ) 趋化功能检测趋化功能检测1.1.原理原理：现在学习的是第33页，共36页琼脂糖平板法琼脂糖平板法 现在学习的是第34页，共36页( (二二) )吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率100(%)计数的白细胞数数胞内含着染菌体的细胞杀菌率现在学习的是第35页，共36页2. 2. 溶菌法溶菌法100min0min9060301(%)）菌落数菌落数或、作用（杀菌率3 3NBTNBT还原试验还原试验 现在学习的是第36页，共36页